Nature子刊 | 最新！时空技术揭示大脑中间神经元的发育轨迹
原位测序技术应用系统阐述了人类胚胎大脑中间神经元(interneuron)的发育规律。日前，华侨大学孙涛教授团队、柯荣秦教授团队等在Nature Neuroscience上发表了原位测序技术的应用文章。该文章通过单细胞测序技术和原位杂交测序技术，对孕9-12周（GW9-12）流产胎儿脑样品，进行mRNA表达的时间空间变化分析，展示了介于神经中枢之间的神经元的发育轨迹。
文章题目：Interneuron origin and molecular diversity in the human fetal brain
发表期刊：Nature Neuroscience
发表时间：2021年11月4日
影响因子：20.071
主要研究团队：华侨大学孙涛教授团队、柯荣秦教授团队等
DOI：www.nature.com/articles/s41593-021-00940-3
研究背景
中间神经元(interneuron)，位于脑下皮质，神经节突起（ganglionic eminence）。解剖学分为中部基质（medial ganglionic eminence, MGE）、边缘基质(lateral ganglionic eminence, LGE)和尾部神经元(caudal ganglionic eminence, CGE)三个部分。其中，中部基质部分的神经元随着发育过程会切线迁移到皮质、海马和纹状体；边缘基质会迁移到嗅觉小球或者纹状体；神经节突起尾部神经元会迁移到皮质。中间神经元作为哺乳动物大脑皮质神经元当中的重要组成成分，主要负责维持大脑的正常功能，其发育异常将引起自闭症和精神分裂症等精神类疾病。
研究方法
本次研究中，研究人员首先对来自4个处于不同发育时期(GW9, GW10, GW11 and GW12)的流产人类胎儿大脑下皮质样本进行常规单细胞测序分析，共得到了40,572个细胞和6个细胞类群，然后利用胎儿大脑整体组织切片做原位测序分析不同细胞类群的在胎脑发育中空间分布及异质性。
研究结果
1. 单细胞测序分析结果
4个时期胎儿脑下皮质神经节突起的测序获得40,572个细胞表达数据基于图论的Louvain聚类分析，结果显示这些细胞可以分为6大类，分别是：P1-P6祖先细胞群(neural progenitor cells, NPCs)、前体细胞群(interneuron precursors, INPs)、髓鞘形成细胞(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)，小胶质细胞（microglia, MG），内皮细胞(endothelial cells, EC)，其他兴奋神经元(other excitatory neurons)，见图1。
图1 单细胞Louvain聚类分析
研究人员进一步对细胞类群基因表达比较分析，（对6大类21小类表达谱进行比较）获得2922个差异基因，并挑选77个标记基因，经随机森林法分类，获得83.4%的区分和预测效果；使用嵌入ForceAtlas2算法的图分区抽象(partition-based graph abstraction, PAGA)方法，绘制神经节突起衍生的各祖先细胞和前体细胞的发育轨迹（图2）。
图2 单细胞测序PAGA发育轨迹分析
2. 下皮质NPC细胞的空间特点
神经节突起祖细胞中共包含6个细分亚群（P1-P6），研究人员通过相关标记基因对其异质性进一步分析，显示P2、P3子类代表分化早期DLX2-/GAD2-细胞群，位于VZ区域，P1、P4、P5、P6子类属于祖先细胞分化晚期DLX2+/GAD2+细胞群，位于SVZ区域。为验证以上分区结果，研究人员对GW12的胎儿脑样品做了冠状面切片原位杂交测序（ISS，in situ sequencing）。首先选用取已知区域标记基因（MGE, LGE, CGE）测试探针，证实其结果与解剖学非常吻合。随后，将单细胞测序发现的标记基因用于ISS检查，发现了MGE、LGE、CGE腹区表达的HES1、PTN和TTYH1基因，具有RGC谱系特征（下图绿色）；下腹区高表达DLX2、 DLX5和INSM1(下图紫色）。结合单细胞测序和ISS技术，发现了胎儿脑下皮质中间神经元祖先细胞标记基因在VZ和SVZ区域的特异性表达（图3）。
图3 MGE、LGE、CGE原位杂交测序
3. MGE衍生的中间神经元前体的时空表达
小白蛋白中间神经元(parvalbumin, PV+)和生长激素抑制素中间神经元（somatostatin, SST+）衍生于下皮质MGE区。对MGE区域特异的中间神经元前体分群中2000个转录本，用Seurat聚类，发现5个子类。并用Slingshort包进行发育轨迹分析，5个子类分为两个轨迹，对应发育前期和MGE腹部(vMGE) lineage-1，以及发育后期和背部(dMGE) lineage-2（图4）。
图4 MGE重新聚类并做轨迹分析
4. LGE衍生的中间神经元前体谱系及空间定位分析
啮齿动物脑中，纹状体投影神经元和嗅觉小球中间神经元从LGE区生成并迁移。在GW9-11样品中，将单细胞测序数据发现的4个LGE子类继续分为多个子类，并使用Monocle2进行轨迹分析（图5）。用GW12胎儿脑样品进行ISS分析，发现轨迹-1中的基因主要表达于背部dLGE，轨迹-2中的基因，高表达于腹部vLGE（图6）。对dLGE和vLGE中特异表达的266个基因，进行GSEA功能富集分析，发现dLGE中的基因与视觉发育相关，vLGE中的基因与神经元投影发育相关。
图5 LGE重新聚类并做轨迹分析
图6 原位杂交测序获得vLGE和dLGE标志基因和位置分布
5. CGE衍生的中间神经元前体的谱系及功能分析
血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP+)、钙网膜蛋白(calretinin, CR+)和络丝蛋白阳性(reelin+)中间神经元发育自CGE，后期主要迁移至supagranular层的大脑皮质。研究人员对CGE群重新聚为5个子类，并标注啮齿动物中作为CGE标志的NR2F1和NR2F2基因，及其共表达的群。并用Monocle2构建发育谱系树（图7）。在拟时序分析中，查看CGE特异的转录因子表达量变化，用Genie构建表达调控网络，Cytoscape工具进行网络可视化。GO富集分析显示，NR2F1参与神经元投影导向功能，ZNF608参与γ氨基丁酸能神经元分化和迁移功能。
图7 CGE重新聚类并做轨迹分析
6. 胎儿时期与成人中间神经元比较
皮质中间神经元包含PV+, SST+和离子通道型血清素受体(5-HT3a, 5-HT3AR+)。啮齿动物研究中显示在迁移前可以检测到中间神经元的不同子类型。作者采集公共数据中成年人脑的γ氨基丁酸能中间神经元数据，获得基于PV、SST、VIP、ID2、NDNF标志基因的5个类（图8）。并对成人脑的中间神经元对比胎儿脑的中间神经元，对PCA前30个主成分作为计算距离矩阵的输入，获得每个组最近的10个近邻。发现51.2%的SST+细胞和62.7%的PV+细胞具有MGE特征。且64%的VIP+细胞和83.7%的ID2+细胞可以比对到LGE类群。同时，55.6%的NDNF+细胞可以比对到CGE类群（图9）。
图8 公共数据集成人脑数据聚类和标志基因
图9 胎儿脑GW9, GW11与成人脑细胞类群比较Alluvial冲积图
结论&展望
本文中，单细胞测序技术主要提供了中间神经元细胞详细分类及其发育轨迹信息，而原位测序技术则提供了中间神经元细胞的空间定位信息，两者优势互补，相辅相成。
“空间全转录组测序技术”被Nature Methods评为2020年度技术方法。目前能同时获得mRNA定量和空间定位信息的技术依据其技术特征主要分为两类，一是原位捕获且原位检测的时空组技术，本文中的ISS技术属于此类；另一类是原位捕获异位检测时空组技术。相较前者，原位捕获异位检测时空组技术通过PolyA捕获，检测基因的范围广、高通量，不需要设计特殊的靶向探针，可以在真核生物中广泛使用。华大Stereo-Seq时空组学技术即属于此类。未来，华大时空组技术等高通量时空组技术将在肿瘤研究、免疫研究、发育生物学、脑神经学、病理研究等方面有重要应用。
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