Cell子刊 | 空间转录组与单细胞分析联合发力，揭秘促进人体造血干细胞发育的分泌因子

研究人员通过结合空间转录组和单细胞分析方法验证得出在腹侧区域富集分泌的内皮素1是促进人体造血干细胞发育的重要因子。这项由英国爱丁堡大学MRC再生医学研究中心和格拉斯哥大学癌症科学研究所共同完成的研究成果，于2020年在线发表在Cell Stem Cell期刊。

文章题目：Multi-layered Spatial Transcriptomics Identify Secretory Factors Promoting Human Hematopoietic Stem Cell Development

发表时间：2020-09-17

发表期刊 ：Cell Stem Cell

主要研究团队：英国爱丁堡大学MRC再生医学研究中心、格拉斯哥大学癌症科学研究所等

影响因子：24.633

DOI：10.1016/j.stem.2020.08.004

研究背景

在小鼠和人的造血系统中最先出现造血干细胞的部位是在胚胎的AGM（主动脉——性腺——中肾）区域。IAHCs（主动脉内造血细胞簇）/HSCs（造血干细胞）是由主动脉内皮细胞向造血命运转化形成的，这个过程称为EHT（内皮造血转化）。在人体胚胎当中，有明确的HSCs出现是在卡内基分期14~17阶段，这与IAHCs出现的时间有交叉重合。HSCs/IAHCs主要出现在背主动脉的腹侧区域，这一部位是人和小鼠主要的造血功能生态位。对小鼠主动脉腹侧极化分泌因子的分析也证实了它们在小鼠造血干细胞发育过程中的重要作用，但其在人体当中相关机制还并不十分明确。利用人胚胎干细胞体外建模，可以发现内皮细胞媒介向造血命运转化，但目前尚不能在人体内追踪到这一变化。

研究策略

转录组分析：LCM-seq、Bulk RNA-seq和scRNA-seq使用卡内基分期16~17阶段的人胚胎样本，所选部位为肝尾侧缘和中肠袢之间的背主动脉。LCM-seq测序深度约为每个样本2900万条reads，Bulk RNA-seq约为每个样本4700万条reads，scRNA-seq测序深度约为每个细胞7万条reads。

功能验证：小鼠模型利用的是 C57BL/6小鼠，人类模型利用H9人胚胎干细胞进行体外建模。

研究成果

1. 造血干细胞发育生态位中的D-V极化信号

为了揭示人体背主动脉内的D-V极化，研究人员使用LCM进行了空间显微解剖。取CS16~CS17胚胎肝尾缘和中肠袢之间的区域（如图1A）， IAHCs/HSCs主要出现于这个区域。实施了两种类型的显微解剖方法。第一组(LCM-seq1，CS17胚胎，n = 3)将主动脉按直径解剖为4段，分别是腹侧(V)、腹外侧(VL)，背外侧(DL)和背侧(D)区域。第二组(LCM-seq2，CS16胚胎，n = 3)从动脉腔向外辐射三个同心细胞层依次被显微解剖，分别为内层(管腔内皮细胞和血管周围细胞)、中层(内皮下基质细胞)和外层（远端基质细胞）（如图1B）。每一部分都进行RNA-seq。

图1

基因集富集分析发现，与V、DL和D相比，VL区域富集的通路数量非常多。VL富集了神经特异性通路（图1D），与腹外侧定位交感神经节极为相似。其中，V显示转化生长因子β（TGF-β）信号富集，之前在小鼠背主动脉中也有观察到的。再者，背主动脉壁和较深基质层之间的D-V区域存在较大差异（图1E），主要表现为内皮和血管周围细胞标志物在内层高表达，随后在中层内皮细胞中表达降低，外层细胞中这些标志物进一步减少。

三个同心层的腹侧区域都富集了通路包括肿瘤坏死因子α信号通路，磷脂酰肌醇激酶靶蛋白信号通路，以及氮氧化物代谢，均与HSC的发育相关。此外，与D_外相比，V_外富集了一些已知的造血因子，包括EPO和TPO。因此所有的背主动脉细胞层均有可能促进造血系统腹侧极化。

2. 肾素和内皮素1在腹侧区域富集分泌

与IAHC形成密切相关的V内富集心脏EGF通路，该途径会受到分泌因子内皮素1(EDN1)和血管紧张素Ⅱ的刺激。如图2A，V_内(相对D_内)和V_中(相对D_中)富集了心脏-EGF通路中的EDN1、EDNRB(内皮素受体B)和AGTR2(血管紧张素受体2)等基因。EDN1从外到内，从背侧到腹侧，呈单调递增的表达梯度（图2C）。

值得注意的是，在表达从D/DL向V/VL增加的3个基因中，REN1（图2D）作用于血管紧张素II和血管紧张素转换酶（ACE）的上游，后者是人AGM区域HSCs的标志物。此外，V_中相比D_中，REN是上调最显著的分泌因子（图2E）。肾素和内皮素1均编码血压调节因子，具有相互作用关系。它们同时发生的腹侧富集暗示了其在造血微环境中的潜在作用。

图2

3. scRNA-seq揭示内皮细胞与HSPCs的谱系关系

为了进一步了解HSPCs（造血干细胞/祖细胞），探索背主动脉的细胞异质性，研究人员分选了CS16阶段2379个背主动脉细胞进行单细胞RNA分析（图3A），使用Leiden算法产生了20个细胞簇（图3B）。根据CD34和CDH5的表达鉴定了10个包含内皮细胞或HSPCs的簇（CL1~CL10）。HSPCs群体表现出静脉标记物和动脉标记物（GJA5和HEY2）的下调。CL5是动脉内皮和造血细胞群之间的“桥梁”群体。基于分区的图形抽象拓扑树（PAGA）显示了一组相互关联的内皮细胞，CL2~CL6（图3D）。这些细胞表达静脉标志物APLNR和NR2F2。CL1与中央内皮细胞网络关联较弱，主要表达动脉标志物（GJA5和HEY2），称为动脉内皮细胞（图3C，3D）。CL9表达红系标记物GYPA和胚胎血红蛋白HBE1、HBZ和HBA2，代表原始红系祖细胞（图3C，3E）。CL10和CL11代表造血干/祖细胞系，前者共表达内皮细胞和造血细胞的标志物，同时PTPRC上调，CDH5下调，后者分化更为成熟一些。

CL12可分化为3种不同亚型的间充质细胞：血管周围细胞——ACTA2⁺PDGFRB⁺CL14以及两种未知的亚型，CYP26A1⁺CL13细胞和SPRR2F⁺CL15细胞。还有3种单独的上皮样EPCAM⁺细胞簇：EMX2⁺CL17，可能与中肾上皮相关；PERP^hiCL18，特性未明；CL19，特异性表达PTH（甲状旁腺激素），是一种成人骨髓中的HSC调节因子。CL20代表POU5F1⁺NANOS3⁺原始生殖细胞（PGCs）（图3B，3C）。

图3

4. 内皮素1促进小鼠和人体造血系统发育

动脉细胞CL1是活性内皮素1的主要来源。利用String对CL1进行蛋白互作分析发现EDN1位于整体网络的中心，并与周围其他区块中心信号分子相互关联：FOS、MMP2、PTGS2和CXCR4（如图4A）。然后又分析了每个切片中Runx1⁺IAHCs的位置与EDN1（RNA和蛋白点）位置的相关性。EDN1热点常位于Runx1⁺IAHCs细胞的附近，具有很强的统计学相关性（如图4B）。

后续又利用小鼠模型和人胚胎干细胞体外建模，针对EDN1做了进一步的功能验证。在小鼠中，分别添加了 REN1，EDN1和EDN2这3种实验因子，和对照组相比，3种实验组细胞均从Mac细胞群体更多地变为非成熟的GEMM细胞群体（图4D），再增殖能力明显增强（图4E）。而在人体模型当中，加入EDN1显著增加了细胞群落形成（CFU-C）,同时非成熟的GEMM细胞群体也显著增加。这些都证明了EDN1可以促进人和小鼠的造血系统发育。

图4

总结

本研究首先使用LCM进行空间显微切割，对分选的主动脉（Ao）细胞群体进行了转录谱分析。进一步使用单细胞RNA-seq分析，揭示了Ao内丰富的细胞异质性。使用空间转录组学研究了人类HSC发育微环境信号，与IAHC形成密切相关的V_内富集了心脏EGF通路。该通路的一个主要调节因子EDN1表现出强烈的腹侧极化。此外，该研究重点关注了内皮素1在HSPC发展中的功能。小鼠和人的功能分析证明内皮素1信号对造血发育有强烈影响。

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