Cell Metabolism | 胰岛素调节人类白色脂肪组织脂肪代谢的细胞生物学机制
瑞典卡罗林斯卡大学医院和皇家理工学院的研究人员将空间转录组技术与scRNA-seq、图像分析相结合，绘制了人类白色脂肪组织（white adipose tissue，WAT）的空间图谱，证实其由多种类型细胞组成，表征了它们的空间分布特征。此文章于2021年8月发表在Cell Metabolism，详细解读如下。
文章题目：Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin
发表时间：2021-08-10
发表期刊：Cell Metabolism
主要研究团队：卡罗林斯卡大学医院、皇家理工学院
影响因子：27.287
DOI：10.1016/j.cmet.2021.07.018
研究背景
人体脂肪组织主要分为白色脂肪组织（WAT）、米色脂肪组织、棕色脂肪组织。其中，WAT广泛分布于体内皮下组织的内脏周围，通过储存和释放脂质，分泌调节热量摄入的因子，在能量平衡中发挥重要作用。此外，由于不同类型的驻留细胞协同作用，WAT具有可塑性。若WAT发生异常，会导致组织功能障碍、胰岛素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病等。因此，WAT的细胞组成和结构在决定组织功能方面起关键作用。
与大脑、胰腺和肝脏等器官相比，WAT没有明显的组织结构，且许多驻留细胞类型缺乏明确的标志物，这给定义WAT微结构带来了挑战。scRNA-seq已被应用于研究脂肪组织的细胞异质性，但其难以探究组织内细胞间的空间关系。再加上成熟脂肪细胞体积大、脆弱且容易漂浮，目前仍不清楚细胞构成异质性和结构对WAT功能的贡献。
研究样本
10例（7名女性、3名男性）个体腹部皮下WAT样本，这些个体在BMI、年龄和HOMA-IR方面存在显著差异。受试者：体重指数（BMI）为19.9~36.4 kg/m2，年龄为38~66岁，胰岛素敏感性（HOMA-IR）为0.29~4.04。
研究策略
首先，使用空间转录组识别到20种不同的细胞类群。然后，通过Stereoscope程序利用已发表WAT基质血管部分的单细胞数据，对本研究数据反卷积分析，确定具有不同特征基因的3种成熟脂肪细胞类别。接着，结合空间转录组根据同型聚类分数和异型聚类，确定不同细胞类别之间的空间关系，并通过特定的marker基因来区分WAT中不同的成熟脂肪细胞。最后，利用在人体内利用高胰岛素-微生物-正血糖钳实验评估并验证不同脂肪细胞对组织功能的贡献。
研究成果
1. 空间转录组学识别人类 WAT 中的多种细胞特征
使用空间转录组技术确定WAT中的细胞类型异质性和定位。获得覆盖27,937个spots的数据进行空间转录组分析，发现每个切片平均检测17,303个独特基因和3,280,607个UMIs（图1B）。使用Seurat v3和ST Utility进行下游分析，通过Harmony校正批次效应、无监督聚类和UMAP降维的组合方法，在WAT中识别到20种不同细胞类别（C01-C20，图1C）。
随后，利用一种空间和单细胞数据的整合分析算法stereoscope，整合已发表的人类WAT基质血管单细胞转录组数据，发现空间数据主要包含了内皮细胞、免疫细胞和祖细胞（图1D）。并根据聚类分析，验证了20种细胞类型中的18种，分别为免疫细胞（C15 单核细胞、C20 M1-like巨噬细胞、C08 M2-like巨噬细胞、C16 树突状细胞、C10 肥大细胞、C18 B细胞、C13 NK细胞）、血管细胞（C05 微血管细胞、C14 经典血管内皮细胞、C17/C19 血管平滑肌细胞）、脂肪祖细胞（C07、C09和C12）、脂肪祖细胞样细胞（C11）和成熟脂肪细胞（C03、C04和C06）。研究人员也对成熟脂肪细胞的比例进行分析，其在C03~C20 细胞类群中占比为31%~57%，这与已有报道一致。由图1E可知，研究人员鉴定了3种具有不同特征基因的成熟脂肪细胞（C03、C04和C06）。
图1 空间和单细胞转录组学数据整合分析确定WAT中18个细胞类型
2. WAT在空间上分为同型和异型细胞簇
为了系统地确定WAT内同类型细胞的组织结构，研究人员计算了每个细胞类别中的spots相邻定位的倾向，即同型聚类评分（图2A），结果显示：所有的免疫细胞、脂肪祖细胞、血管细胞和成熟脂肪细胞，内部各细胞类型的同型聚类评分分布差异大，表现出较大波动跨度（图2B、2C）。在免疫细胞中，M1-like巨噬细胞（C20）、B细胞（C18）和肥大细胞（C10）通常呈簇状分布；而M2-like巨噬细胞（C08）和NK细胞（C13）分布在整个组织中。脂肪祖细胞中，C09、C11较C07、C12更易成簇分布。进一步观察苏木精和伊红（H&E）染色的组织切片，发现C09位于纤维/血管结构上，C11位于含有脂肪细胞的区域。
图 2 WAT常驻细胞显示形成同型细胞簇的倾向性很大
为了确定不同细胞类别（异型）之间的空间关系，研究人员开发了一种算法来执行成对的、异型的邻域分析（图3A），分析表明，所有免疫细胞、脂肪细胞前体细胞、血管细胞以及成熟脂肪细胞在同型评分上都显示出很大的跨度（图3B、3C）。与预期相符，较大血管结构的细胞类型 (C14、C17和C19)彼此靠近，M2-like巨噬细胞（C08）经常位于两种脂肪祖细胞（C09同型簇和分散的C12）附近（图3C）。此外，树突状细胞（C16）与其他免疫细胞表现出较高的异型评分，而两类成熟脂肪细胞（C03、C04）相互共定位，并与C06脂肪细胞明显分离。总之，异型邻域分析表明，WAT具有比预期更加明确的、特定的细胞-细胞关系。
图 3 WAT中特异细胞群表现为异型簇
3. 人类WAT含有不同类型的成熟脂肪细胞亚群
研究人员根据特征表达谱，鉴定了3种成熟脂肪细胞(C03、C04和C06)的marker基因：LEP（编码脂肪因子瘦素）、PLIN1/PLIN4（编码脂滴蛋白Perilipin-1和-4）以及SAA1/SAA2（编码血清淀粉样蛋白A1和A2急性期相蛋白），分别是对应各亚群中独特的基因（图4A）。因此，这三类细胞分别被命名为AdipoLEP、AdipoPLIN和AdipoSAA。公共数据库中脂肪组织bulk RNA-seq数据中高表达基因的富集位置，与这3种脂肪细胞的top 50 maker基因在bulk RNA-seq的高表达基因中富集位置有差异（图4B），说明AdipoLEP、AdipoPLIN和AdipoSAA确实代表了不同类型的脂肪细胞。进一步分析发现，这些亚型的表达模式互补（图4C），例如，参与三酰甘油生物合成和水解的基因在AdipoPLIN中高表达，但在AdipoLEP中表达不足。
图 4 WAT包含3个不同的脂肪细胞亚群
4. 脂肪细胞大小不是脂肪细胞异质性的决定因素
脂肪细胞的大小和数量会影响WAT的功能。10例受试者的细胞类别占比分析发现，（C03）AdipoLEP是最丰富的细胞类群，其次是（C04）AdipoPLIN和（C06）AdipoSAA。接下来，探究了体重指数对人WAT中成熟脂肪细胞亚型比例的影响，发现与非肥胖者相比，肥胖者的AdipoPLIN细胞数较少，而AdipoLEP和AdipoSAA细胞数相似。此外，发现年龄不影响成熟脂肪细胞亚型的比例。
研究人员开发了一个自动图像分析流程，能够将脂肪细胞大小数据与相应位置spot的基因表达谱整合在一起（图5A）。通过图像分析测量了10名受试者样本中AdipoLEP、AdipoPLIN和AdipoSAA的平均脂肪细胞直径，结果显示，AdipoPLIN平均直径（74 μm）小于AdipoSAA（76 μm）和AdipoLEP（77 μm）（图5E）。为了进一步探究细胞大小是否是脂肪细胞亚型的决定因素，研究人员分析了小脂肪细胞（第一个四分位数）和大脂肪细胞（第四个四分位数）之间差异表达的基因（图5F），结果显示，AdipoLEP 和AdipoPLIN中，小脂肪细胞和大脂肪细胞间尽管表达差异基因较少、但具有差异（图5G）。
图5 脂肪细胞大小不是脂肪细胞异质性的决定因素
5. 体内脂肪细胞亚群对胰岛素的不同反应
为了深入了解脂肪细胞亚型的功能，研究人员综合分析了56名女性的WAT转录组数据，同时，对新鲜分离的脂肪细胞进行脂肪分解/生成能力的测量。AdipoPLIN、AdipoLEP和AdipoSAA3种脂肪细胞亚型的marker基因形成了3个单独、共同调控的簇（图6A），肥胖群体中AdipoPLIN比例降低且与BMI呈负相关，AdipoSAA的特征基因值也与BMI呈负相关，而AdipoLEP与BMI呈正相关（图6B）。
脂肪组织可在儿茶酚胺的刺激下分解脂肪，而胰岛素抑制这种分解，并促进脂肪生成。通过多元回归分析校正BMI后（图6C），发现AdipoPLIN与儿茶酚胺介导的刺激作用、对胰岛素抑制的敏感性呈正相关，而AdipoLEP与这两个指标没有或只存在微弱的负相关关系；对于胰岛素刺激的脂肪生成，AdipoPLIN呈正相关，AdipoLEP呈负相关，而AdipoSAA与任何指标均无显著相关性。可以发现，AdipoPLIN对胰岛素具有更显著的应答。
图6 AdipoPLIN与全身水平的脂肪细胞亚型、胰岛素敏感性有关
为了在体内验证上述发现，研究人员让10位受试者接受了高胰岛素-正常血糖钳夹2 h治疗，采集了其中4位胰岛素敏感性差异较大的受试者的WAT样本，进行空间转录组分析（图7A、7B）。在不同胰岛素水平下，即高胰岛素血症与禁食状态下，获得的空间转录组基因表达差异明显（图7C）。胰岛素应答基因中，只有极少量的基因是3种脂肪细胞共有的marker基因，这表明：尽管胰岛素能快速诱导转录组变化，但在这期间，它不是脂肪细胞异质性的驱动因素（图7D）。
由于上面分析是用所有spots进行分析的，未提供每种脂肪细胞对胰岛素应答的差异。接下来，在脂肪细胞类型水平进行胰岛素反应分析。结果显示，AdipoPLIN中胰岛素应答基因较多，AdipoSAA中胰岛素应答基因较少，而AdipoLEP中应答基因只有1个（图7E）。考虑到4名受试者在胰岛素敏感性方面具有明显差异，研究人员评估了个体之间对胰岛素的转录应答是否存在定量差异，发现AdipoPLIN的应答反映了M值，而这在AdipoLEP、AdipoSAA中不明显（图7F、7G）。
综上可以看出，在体内对胰岛素的整体转录应答主要受AdipoPLIN影响，其他两种脂肪细胞亚型对高胰岛素血症应答不明显。
图7 只有 AdipoPLIN 在体内对胰岛素有转录反应
总结
研究人员综合空间转录组、单细胞转录组和图像分析，鉴定了人腹部皮下WAT的18种细胞类型，以及它们各自在组织空间上的分布特征，并鉴定到3种大小相似但不同类型的成熟脂肪细胞：AdipoLEP、AdipoPLIN和AdipoSAA。回归分析显示，AdipoPLIN、AdipoSAA与BMI之间存在负相关，而AdipoLEP与BMI呈正相关。在脂肪分解中，AdipoPLIN与分解指标存在正相关，而AdipoLEP、AdipoSAA与脂肪分解不相关；在胰岛素刺激的脂肪生成中，AdipoPLIN与其呈正相关，AdipoLEP与其呈负相关，AdipoSAA与其无明显相关性。通过高胰岛素-正常血糖钳夹在体内刺激胰岛素实验，证实了AdipoPLIN 是WAT中响应胰岛素的主要脂肪细胞亚群。该研究提供了人WAT的空间转录组学图谱，揭示了人WAT的细胞组成和结构特征，以及发现了胰岛素调节脂肪代谢的细胞生物学机制，为从组织空间原位理解脂肪功能奠定了基础。
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