单细胞水平解析慢性神经退行性疾病的发病机制 | 时空简讯24期
时空简讯第24期。
阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD；也叫做老年性痴呆）是最为常见的慢性神经退行性疾病，其次是帕金森病（Parkinson's disease，PD），均是由脑部功能出现退化引起的，但两者的致病机理不同。本期选取发表于Nature、cell等权威期刊的8篇文章，图文并茂地从细胞和分子水平概述了AD和PD的发病机制，供参考了解。
阿尔茨海默症
Alzheimer’s Disease
scWGS揭示阿尔茨海默症神经元的DNA突变模式
Nature [IF: 49.962]
① 经过流式分选和多重置换扩增 (multiple displacement amplification，MDA)，从8个AD患者和18个对照个体的海马体和前脑皮层，分别获得了91和159个神经元的全基因组信息，发现特征A类型（signature A；共有A/B/C三种类型）的体细胞单核苷酸变体（somatic single-nucleotide variants，sSNV）在所有神经元中均会随年龄的增长而增加，呈现与年龄相关的“时钟样”特征。
② sSNV负荷分析发现，AD患者的sSNV明显多于基于年龄的预期，且突变普遍分布在整个基因组中，提示体细胞突变有可能是次要的，不是疾病发病机制中特定的初始事件，而是由引发AD的其他事件所诱发和导致的。
③ 突变特征分析发现，与对照组相比，AD患者神经元的特征C类型的突变显著增加，其中ERCC6、XPA或XPD的突变导致神经元中转录偶联核苷酸切除修复（transcription-coupled nucleotide excision repair，TC-NER）缺陷，这与癌症相关的SBS8特征突变相似，促进了特征C类型突变的发生，同时DNA氧化也可能是AD患者sSNV过多的原因。
④ 从GTEx提取正常脑PFC表达数据，发现随着基因表达量增加，特征A突变增加，而特征C突变会减少，且转录后的链上有明显的C>A突变的链偏好，表明转录相关机制中的错误，也在AD神经元中sSNV的产生中起到了作用。
⑤ 通过初级模板定向扩增（primary template-directed amplification，PTA），重新获得了69个神经元的基因组信息，两种scWGS方式均一致显示了AD的致病突变机制包括DNA氧化、NER DNA修复和转录活性等。（Cole）
scWGS实验流程图
Somatic genomic changes in single Alzheimer’s disease neurons.
2022.04.20, DOI: 10.1038/s41586-022-04640-1
研究文章；疾病病理，脑及神经科学；人，海马体，前脑皮层，阿尔茨海默症，单细胞全基因组，体细胞DNA突变；Michael B. Miller, August Yue Huang, Michael A. Lodato, Eunjung Alice Lee, Christopher A. Walsh; Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, Boston Children’s Hospital, Broad Institute of MIT and Harvard, University of Massachusetts Chan Medical School, Howard Hughes Medical Institute; USA.
空间转录组学和原位测序研究阿尔茨海默症
Cell [IF: 41.582]
① 通过对3、6、12和18月龄的AppNL-G-F（基因编辑的AD小鼠模型）和C57BL/6小鼠的大脑进行冷冻切片，获得了3个相邻的冠状动脉切片，采用空间转录组（In situ 2D-RNaseq）在超过500个小组织结构域（tissue domains，TD）中原位检测淀粉样斑块周围（直径为100 mm）的全转录组变化，并用原位测序法进行验证，解析了AD病理特征邻近的失调细胞网络。所有信息可访问https:// www.alzmap.org/获取。
② 从小鼠大脑冠状切片中获取到10,327个转录组表达谱，聚类后可清晰地分为CA1、CA3和DG三个亚区，进一步的加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）描述了2个表现出对β-淀粉样蛋白（β-amyloidvAβ）沉积高度敏感的基因共表达网络：斑块诱导基因（plaque-induced gene, PIGs）模块、少突胶质细胞基因（oligodendrocyte genes, OLIGs）模块。
③ 57个PIGs基因共表达网络（包括补体系统、氧化应激、溶酶体和炎症相关基因）包含多种细胞的反应，在AppNL-G-F小鼠中，随着Aβ负荷增加，PIGs逐渐与之共表达，且该共表达网络在AD后期变化显著。
④ OLIGs基因共表达网络由165个基因组成，主要参与髓鞘形成，在轻度Aβ暴露时高表达，而在Aβ累积密集的微环境下表达降低。
⑤ 从3名AD患者和非AD对照供体中获取大脑样本，通过原位测序证实了小鼠大脑中PIGs和OLIGs的变化。（此木/阿多/Lina）
小鼠大脑空间转录组分析示意图
Spatial transcriptomics and in situ sequencing to study Alzheimer’s disease.
2020.07.22, DOI: 10.1016/j.cell.2020.06.038
研究文章；疾病病理，脑及神经科学；小鼠，人，大脑，阿尔茨海默症，空间转录组, 原位测序；Wei-Ting Chen, Ashley Lu, Mark Fiers, Bart De Strooper; VIB Center for Brain & Disease Research, Leuven Brain Institute, Belgium.
帕金森病
Parkinson’s Disease
帕金森病中AGTR1+的多巴胺神经元亚型选择性衰退
Nature Neuroscience [IF: 24.884]
① 基于流式荧光分选和snRNA-seq，从8个捐献者中获得了184,673个细胞的高质量人脑黑质图谱，其中包含5,684个高质量的多巴胺（dopamine，DA）神经元，自聚类为10簇，SOX6+和AGTR1+群为最主要亚群。
② 对来自人、食蟹猕猴、树鼩和鼠的DA神经元进行跨物种整合，可聚类成8簇，且存在一簇（标识为CALB1_GEM）仅由灵长类的DA神经元构成，在啮齿动物中缺乏同源种群，印证了灵长类动物DA在进化上具有很强的保守性，但也存在少部分的灵长类特化现象。
③ 通过Slide-Seq对猕猴中脑的DA神经元进行定位，其中SOX6+的DA神经元主要分布在黑质致密部（substantia nigra pars compacta，SNpc）的腹侧层，而CALB1+的DA神经元主要集中于SNpc的背侧层，SOX6_AGTR1群体强烈的腹侧定位提示了它特别容易发生帕金森病相关的退行性变。
④ 分析PD患者和老年人对照样本之间的细胞类型丰度，发现PD患者DA神经元的下降最显著，其不同亚型的易损性不同，其中SOX6_AGTR1群下降最显著。
⑤ 家系研究发现了26个基因的突变会增加PD风险，而SOX6_AGTR1细胞亚型中PD遗传风险基因的表达量最显著。
⑥ 最脆弱的SOX6_AGTR1亚群中富含TP53、NR2F2等特异转录因子，这与其在PD患者神经死亡和衰退相关。（Cole）
基于NR4A2抗体的富集策略和snRNA-seq分析工作流程
Single-cell genomic profiling of human dopamine neurons identifies a population that selectively degenerates in Parkinson’s disease.
2022.05.05, DOI: 10.1038/s41593-022-01061-1
研究文章；疾病病理，脑及神经科学；人，小鼠，猴，树鼩，脑，多巴胺神经元，帕金森病，神经元退化，Slide-seq，snRNA-seq，单细胞转录组，空间转录组；Tushar Kamath, Abdulraouf Abdulraouf, Evan Z. Macosko; Broad Institute of Harvard and MIT, Harvard University,Massachusetts General Hospital; USA.
scRNA-seq揭示了帕金森病患者中脑特异性神经元状态
Brain [IF: 13.501]
① 对5例特发性帕金森病（idiopathic Parkinson's disease，IPD）患者及6例年龄匹配的健康对照组的中脑组织进行snRNA-seq，分别获得了19,002个（IPD组）、22,433个（对照组）的单细胞核基因表达图谱。
② 通过细胞类型注释和激光显微捕获技术验证，将人类中脑分为12个主要的细胞类群，并鉴定了一群只存在于IPD组的细胞类型：CADPS2high细胞，高表达CADPS2基因，低表达TH 基因，推测其可能为功能失调的多巴胺神经元。
③ IPD组中黑质小胶质细胞和星型胶质细胞增加，并且小胶质细胞多处于形变状态，可以分为P2RY12high、IL1Bhigh、GPNMBhigh、HSP90AA1high四个亚型，并表现为IL1B、GPNMB、HSP90AA1表达水平升高的促炎轨迹，而星形胶质细胞CD44high亚群在活化轨迹末端高度富集。
④ IPD组少突胶质细胞比例减少，剩余细胞中具有应激诱导作用的S100B基因表达上调。
⑤ 评估中脑细胞型标记基因与帕金森病相关基因变异的富集情况，发现帕金森病风险变异与特发性帕金森病病例中胶质细胞和神经元特异性基因表达模式相关。（邢雅楠）
中脑组织处理和细胞核提取方法示意图
Single-cell sequencing of human midbrain reveals glial activation and a Parkinson-specific neuronal state.
2022.04.29, DOI: 10.1093/brain/awab446
研究文章；疾病病理，脑及神经科学；人，脑，中脑黑质，帕金森病，小胶质细胞，神经炎症，scRNA-seq; Semra Smajić, Cesar A. Prada-Medina, Anne Grünewald, Malte Spielmann; University of Luxembourg, Max Planck Institute for Molecular Genetics, Kiel University, University of Lübeck, Germany.
scRNA-seq联合scBCR-seq全面解析帕金森病患者的外周血B细胞
Frontiers in Immunology [IF: 7.561]
① 采集8例PD患者和6名健康人的外周血，通过FACS分选CD19+B细胞并进行scRNA-seq和scBCR-seq，共获得10,466个B细胞（PD患者6,681个细胞，健康对照3,785个细胞），利用测序结果对PD病人的外周B细胞转录组及免疫组库特征进行了全面分析，为PD发病过程中的体液免疫反应特征提供了新的见解。
② 与健康对照组相比，PD患者的幼稚型（naive）B细胞显著减少，记忆型（memory）B细胞显著增加，且记忆B细胞亚群有明显的克隆扩增，并且上调了MHC II基因（HLA-DRB5、HLA-DQA2和HLA-DPB1）和转录因子激活蛋白1（AP-1），表明PD患者的B细胞被激活，其抗原呈递能力增强。
③ PD患者中IgG和IgA型别抗体增加，并且抗体型别转换重组事件发生更频繁。此外，存在V基因（如IGHV2-5、IGHV1-3、IGHV4-61等）和J基因（如IGKJ2和IGLJ3等）的使用偏好，证明了PD患者中的克隆趋同选择现象。（Nano Lyu）
研究技术路线图
Global characterization of peripheral B cells in Parkinson’s disease by single-cell RNA and BCR sequencing.
2022.02.16, DOI: 10.3389/fimmu.2022.814239
研究文章；疾病病理，脑及神经科学；人，脑，帕金森病，B细胞，scRNA-seq, scBCR-seq, 适应性免疫反应; Pingping Wang, Lifen Yao, Huan Nie, Qinghua Jiang；哈尔滨工业大学，哈尔滨医科大学第一附属医院；中国
Tau蛋白病
Tauopathy
小鼠小胶质细胞NF-κB通路的激活对tau蛋白病的驱动机制
Nature Communications [IF: 14.919]
① 在小鼠tau蛋白病的体外和体内模型中，将NF-κB作为中心转录因子，利用基因编辑和转录组测序技术，确立了小胶质细胞的NF-κB信号在调节tau扩散和tau病毒性中的作用，揭示了小胶质细胞NF-κB通路的激活在小鼠中驱动tau蛋白病进展的相关机制。
② 用tau蛋白纤维处理原代小鼠小胶质细胞，通过转录组数据的差异基因分析和基因富集分析，证实了tau纤维和单体都可以激活小鼠小胶质细胞的NF-κB信号通路，且IκB激酶复合体亚单位IKKβ（Ikbkb）被确定为tau介导的小胶质细胞发生转录变化的核心上游调控因子之一。
③ 通过对小鼠小胶质细胞NF-κB基因通路的激活或失活，证明NF-κB通路可以加速小胶质细胞对tau蛋白的加工、释放、聚集和扩散，并通过神经炎症等多种方式扩增其神经毒性。
④ 小胶质细胞NF-κB失活可部分恢复小胶质细胞的稳态，并保护小鼠空间学习记忆功能；NF-κB的失活改善了由tau介导的转录改变和小胶质细胞的自噬缺陷，同时增加了神经元内的tau包涵体。
⑤ scRNA-seq分析小鼠大脑皮层的小胶质细胞，发现NF-κB通路的激活是小胶质细胞处在tau蛋白相关病理状态下的必要条件。（Cole）
注：tau蛋白病（tauopathy）是一类以tau蛋白的病理性聚集为特征的神经退行性疾病，可分为原发性tau蛋白病（如皮克病）和继发性tau蛋白病（如阿尔兹海默症）。这类疾病呈现出多样化的临床综合征，不同患者之间的表现存在一定差异。
小胶质细胞NF-κB信号通路驱动tau蛋白在神经递质病变中扩散和毒性作用的模型
Microglial NF-κB drives tau spreading and toxicity in a mouse model of tauopathy.
2022.04.12, DOI: 10.1038/s41467-022-29552-6
研究文章；疾病病理，脑及神经科学；小鼠，大脑，tau蛋白病，小胶质细胞，NF-κB通路，scRNA-seq; Chao Wang, Li Gan, Wenjie Luo; Gladstone Institutes, University of California; USA.
时空技术
Spatial-Temporal Technology
用琼脂糖PCR进行高灵敏性、低偏性的转录组测序
ACS Applied Materials & Interfaces [IF: 9.229]
① 开发了用于扩增反应及转录组建库的低熔点琼脂糖（low melting point agarose）PCR新方法，提高了PCR反应的敏感性、均匀性，降低了转录偏差。
② 低熔点琼脂糖在PCR反应中处于液态及凝固态交界的状态，通过单分子荧光共振能量转移实验，证明了低熔点琼脂糖具有将折叠平衡状态转移到更紧密状态的效果，具有分子拥挤效应。
③ 通过对比加入低熔点琼脂糖前后的PCR产物浓度，发现加入低熔点琼脂糖的PCR产量显著增加，且能够将低起始量的RNA产物扩增出来；同时发现，相同起始量的RNA，低熔点琼脂糖PCR较普通PCR需要更少的循环，即可获得目标cDNA产量，表明低熔点琼脂糖PCR反应具有更高的敏感性。
④ 多重PCR和定量PCR实验发现，低熔点琼脂糖PCR的产物比例更接近真实比例，说明低熔点琼脂糖PCR提高了扩增反应的均匀性。
⑤ 将低熔点琼脂糖PCR用于Smart-seq（gel SMART）建库中的逆转录和预扩增步骤，与常规实验方法结果对比发现，低熔点琼脂糖PCR的结果具有更高的重复性和同质性，可以更好地体现预扩增的基因表达，说明低熔点琼脂糖PCR的高灵敏性和低扩增偏差。
⑥ 对PD小鼠的大脑皮质、海马区和纹状体进行gelSMART bulk转录组测序，发现纹状体区域表达更多PD常见基因，表明纹状体可能与PD发生更相关；加权共表达网络分析发现，三个脑区的中枢基因（hub gene）都与线粒体功能、氧化还原反应、凋亡等相关，可能是PD相关的候选基因和潜在的治疗靶标；对三个脑区进行GO和KEGG分析，发现KEGG途径共享84个重叠基因，它们的共同调控基因是蛋白酶体基因的主要转录因子Nrf1，该基因已被证明与阿尔兹海默症、PD和亨廷顿病的诊断和治疗密切相关。(蓉宝）
基于琼脂糖PCR实验流程示意图
Sensitive and low-bias transcriptome sequencing using agarose PCR.
2022.04.21, DOI: 10.1021/acsami.2c02133
研究文章；时空技术，疾病病理，脑及神经科学；小鼠，大脑，帕金森病，RNA-seq, Smart-seq，空间转录组，琼脂糖PCR；Ying Zhou, Xiangwei Zhao, Qinyu Ge；东南大学；中国
靶内微剂量给药对多种药物颅内药效的深度表型研究
Frontiers in Bioengineering and Biotechnology [IF: 5.89]
① 建立了一个微型化的植入式微型装置（miniaturized implantable microdevice，IMD）平台，应用IMD在模型鼠的特定脑区，单药或多药组合以多种微剂量方式释放，然后对IMD周围组织进行组织病理、蛋白组学和药代动力学分析，快速检测新药物或新疗法对原位脑组织的病理生理影响。
② IMD平台以聚乙二醇为药物介质，可控制药物释放速率和药物浓度，最高可检测16种药物对脑微环境的重塑，测定获得引起有益免疫反应的最佳药物及浓度。
③ 在AD模型鼠中，应用多重免疫荧光技术，发现4-氨基苯甲酸酰肼和柳氮磺胺吡啶能减少与神经炎性、毒性相关的活化的星形胶质细胞和小胶质细胞；应用空间蛋白组技术可检测到tau、磷酸化tau（T231和S404）和脑啡肽酶等AD标志蛋白也有所减少；也可鉴定到药物对特异性T细胞活化和巨噬细胞极化的效应。
④ 在其他大型动物上，可应用大的、多池IMD装置或多重IMD装置联用；也可以与已有活检或介入手段并用，以获取功能性药物数据，且正在脑瘤患者上进行临床试验。
⑤ 与整合了光学检测的IMD装置正在研发中，未来在中枢神经系统或将无需组织切除即可进行药效分析。（舟江海）
*注：16种药物包括米诺环素、伏立诺他、多奈哌齐、4-氨基苯甲酸酰肼、利鲁唑、紫杉醇、柳氮磺胺吡啶、锡中卟啉、P7C3、依托莫昔、丁硫氨酸亚砜胺、MK2206、AGI-25696、双-2-(5-苯基乙酰胺基-1,3,4-噻二唑-2-基)乙基硫醚、美金刚胺、AGI002596等
小型植入式微型设备应用于鼠脑的植入、药物释放、处理和分析的流程示意图
Intratarget microdosing for deep phenotyping of multiple drug effects in the live brain.
2022.03.18, DOI: 10.3389/fbioe.2022.855755
研究文章；时空技术，疾病病理，脑及神经科学；微装置，聚合物配方，阿尔茨海默症，药物敏感性，原位，空间蛋白组学；Jennifer Kim, Sebastian W Ahn, Kyle Deans, Oliver Jonas; Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, USA.
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