Science | spatial-CUT&Tag：细胞水平的空间分辨染色质修饰图谱

美国耶鲁大学的研究团队开发了一种全新空间组学技术：spatial-CUT&Tag，可实现在冷冻组织切片上进行组蛋白修饰的空间分辨全基因组分析，且无需解离处理。并应用spatial-CUT&Tag解析了小鼠胚胎发育和出生后大脑发育的空间染色质状态，揭示了组织类型特异性表观遗传学调控。此文章在2022年2月发表于顶级学术期刊Science，以下为文章的详细解读。

文章题目：Spatial-CUT&Tag: Spatially Resolved Chromatin Modification Profiling at the Cellular Level

发表时间：2022-02-10

发表期刊：Science

主要研究团队：美国耶鲁大学樊荣教授研究团队

影响因子：63.714

DOI：10.1126/science.abg7216

研究背景

染色质状态决定了基因组功能，并且受到细胞类型特异性的调控。尽管现在的单细胞测序技术能够对单细胞的表观基因组进行分析，但整合单细胞组织来源的空间信息仍具有挑战性。耶鲁大学樊荣教授研究团队开发了一项新的空间组学技术——spatial-CUT&Tag，能够在空间和全基因组水平上解析组织发育的表观遗传机制，实现了与发育和疾病相关的表观遗传调节的空间映射。

技术原理

sptial-CUT&Tag技术可实现全基因组尺度的空间组蛋白修饰分析。首先向固定的组织切片加入与组蛋白特异性结合的一级抗体，通过二抗增强转座酶的栓系作用，转座酶经Mg离子的激活后切割与目标蛋白结合的DNA片段，并在其两端添加adapter。之后，通过微流控技术对DNA片段添加barcode A和barcode B序列，将组织进行空间二维编码——由于两种barcode的微流方向互相垂直，通过barcode A与barcode B的不同组合就可以确定DNA片段的位置信息。组织切片在完成二维编码后成像，用于后续分析中表观基因组图谱关联空间信息。最后，收集DNA片段，构建文库，完成上机测序。

图1 Spatial-CUT&Tag操作流程示意图

研究成果

1. spatial-CUT&Tag的基准测试

研究人员应用spatial-CUT&Tag检测了E11小鼠胚胎中H3K27me3（抑制基因座）、H3K4me3（激活启动子）和H3K27ac（激活增强子和/或启动子）的抗体，在50 μm分辨率下，数据有较高的基因组覆盖率和低背景水平。将在20 μm分辨率的spatial-CUT&Tag数据与已发表的小鼠大脑的scCUT&Tag数据比较（图2B），发现在相同测序深度下spatial-CUT&Tag检测到了更多的unique fragments（图2C；但spatial-CUT&Tag的FRiP比scCUT&Tag低，文献提到可能是用了冷冻切片的缘故，冷冻切片会影响染色质结构并产生更大的背景噪音）。通过染色质状态对细胞类型从头鉴定，将聚类的结果比对到原有的空间位置，确定了与H&E染色组织切片相一致的空间分布模式（图2E~G）。

为了对spatial-CUT&Tag空间切割和标记进行基准测试，将器官特异性的Chip-seq数据（ENCODE数据库）投射到该研究的UMAP嵌入中，发现细胞类型的鉴定和ChiP-seq投影匹配良好，区分了E11小鼠胚胎中主要的细胞类型（图2G、H）。

上述结果表明，spatial-CUT&Tag能够以高空间分辨率解析主要组织结构。

图2 spatical-CUT&Tag数据与其他数据比较

2. 小鼠胚胎空间定位与整合分析

为了确定小鼠胚胎发育过程中的空间修饰模式，研究人员检测了样本组蛋白修饰在不同细胞类型时特异性标记基因的活性和空间定位（图3A、B）。通过计算染色质沉默评分（chromatin silencing score，CSS）来评估标记基因表达量，发现H3K27me3会沉默标记基因表达，活跃的基因具有较低的CSS——因为缺少H3K27me3修饰。比如，Hand2是血管发育所必需的，在心脏形态发生过程中起着重要作用，显示心脏中极少H3K27me3富集。而对于H3K4me3和H3K27ac，因为它们与基因激活有关，所以使用基因活性评分（gene activity score，GAS），例如，Nfe2是调节红细胞和造血细胞成熟和分化所必需的，它在肝脏和心脏均在一定程度上活跃。

为了预测增强子及其靶基因细胞簇的基因调控相互作用，研究人员将候选增强子的scRNA-seq和H3K27ac修饰的基因表达相关联（图3C）。基于相关性的图谱，成功地预测了一些增强子-基因的相互作用。例如，预测的Ascl1和Kcnq3增强子在中枢神经系统（C1、C2、C3和C6）中富集，与VISTA验证结果一致。

整合scRNA-seq数据与spatial-CUT&Tag数据来识别细胞类型（图3D~H），检测到多种器官特异性细胞类型。例如，红细胞系的细胞只富集在肝脏中；心肌类型细胞只在心脏区域被发现到；软骨细胞和成骨细胞在胚胎面部突起广泛存在；抑制性中间神经元高度富集在脑干。

上述结果表明，单细胞转录组数据与空间表观组数据整合能够对细胞类型进行更加准确地定义，并可得到不同细胞类型染色质修饰状态的空间分布信息。

图3 小鼠胚胎空间定位与整合分析

3. 免疫荧光染色的小鼠嗅球组织切片的空间定位

研究人员通过将组织切片的spatial-CUT&Tag和免疫荧光染色结果相结合，进一步证实了spatial-CUT&Tag数据的准确性（图4）。首先用核DNA染料DAPI对小鼠嗅球组织切片染色，然后进行20 μm分辨率下H3K27me3抗体的spatial-CUT&Tag分析，区分出了主要细胞类型，包括肾小球（C1）和颗粒层（C2），并通过原位杂交验证了H3K27me3修饰的空间模式。此外，通过对细胞核的DAPI染色，研究人员可以选择感兴趣的像素，如包含单个细胞核或显示特定组蛋白修饰的像素，允许在不分离组织的情况下提取原位单细胞表观基因组数据。

图4 免疫荧光染色小鼠嗅球组织切片的空间映射

4. 小鼠大脑的空间定位和整合分析

研究人员将spatial-CUT&Tag（20 μm分辨率）应用于P21小鼠大脑样本，无监督聚类结果显示出明显的空间特征（图5A~C）。研究人员分析了特定标记基因的空间模式，以区分细胞类型，并将其与单细胞转录组图谱中的基因表达模式进行比较（图5D、E）。众所周知，Polycomb在胚胎期皮层的建立中发挥作用，本研究结果显示，H3K27me3也参与了出生后阶段大脑皮层身份的维持。为了研究活性标记和抑制性标记之间的相互作用，并推断出潜在的H3K4me3/H3K27me3二价性，研究人员识别了所有H3K4me3标记的细胞簇特有的活性启动子，并绘制了H3K4me3和H3K27me3的信号。与预期的一样，当启动子在各自的细胞簇H3K4me3中富集时，H3K27me3信号被耗竭。然而，在少突胶质细胞和中棘神经元中，在少数标记基因周围也观察到H3K27me3信号。

为了进一步识别细胞类型，研究人员将spatial-CUT&Tag数据与已发表的scCUT&Tag和scRNA-seq数据集进行了整合。结果显示，在H3K4me3数据集中，小胶质细胞、成熟少突胶质细胞、中棘神经元、星形胶质细胞、兴奋性神经元分别在簇1、2、3、4、7中富集，并进一步鉴定出神经元亚群（图4G~J）。此外，spatial-CUT&Tag与scRNA-seq或scCUT&Tag的整合可以预测scRNA-seq或scCUT&Tag中的特定细胞类型定位于哪个区域。例如，研究人员发现，成熟的少突胶质细胞（MOL1）在胼胝体中丰富，而内侧脊髓神经元（MSN2）存在于纹状体中，TEGLU3兴奋神经元存在于皮层6，这与之前的结果一致，但这是由表观遗传修饰状态决定的。

图5 小鼠大脑的空间映射和综合分析

总结

spatial-CUT&Tag将单个细胞的表观基因组、转录组和蛋白质组提升到空间层面，结合原位CUT&Tag化学、微流控DNA条形码和NGS方法，无偏倚地分析组织发育的表观遗传机制，对研究发育和疾病相关机制有重大意义。

综上所述，该研究基于NGS方法，开发了可用于空间解析组蛋白修饰的全基因组图谱的技术——spatial-CUT&Tag。研究人员利用spatial-CUT&Tag解析了小鼠胚胎发育中染色质修饰状态，揭示了空间维度的组织类型特异性表观遗传调控，同时揭示了小鼠出生后大脑皮层发育的表观遗传调控机制和由组蛋白修饰决定的细胞类型空间模式。spatial-CUT&Tag通过绘制与发育和疾病广泛相关的表观遗传调控图谱，为空间组学增加了一个新维度。

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