Nature | 利用空间转录组解析良、恶性组织的拷贝数变异

来自英国牛津大学、瑞典皇家理工学院等的研究团队，基于空间转录组学来推断良性和恶性组织的空间拷贝数变异（copy number variations，CNVs），揭示了肿瘤内与附近良性组织不同的克隆模型，并发现组织学良性组织的基因组不稳定性，这可能代表了癌症进化的早期事件。该文章在2022年8月发表于Nature，以下是文章的详细解读。

文章题目：Spatially Resolved Clonal Copy Number Alterations in Benign and Malignant Tissue

发表时间：2022-08-10

发表期刊：Nature

主要研究团队：英国牛津大学、瑞典皇家理工学院等

影响因子：69.504

DOI：10.1038/s41586-022-05023-2

研究背景

癌症组织通常发生了一系列的体细胞突变，明确良性组织向恶性组织的体细胞突变有助于提高肿瘤的早期诊断。然而，不同于生殖系的突变，体细胞突变只存在于一小部分细胞中。为了获得这些罕见的不可遗传突变的空间信息，绝大多数研究通过激光捕获显微切割来探索组织学或生物学标志定义的组织区域的突变状态，甚至是单细胞精度的突变。但这些研究的组织切片只能收集和检测有限数量的空间区域或单个细胞，从而使得相应的研究存在固有的偏差。目前空间转录组已经成为全基因组基因表达分析的有利工具，其可以无偏倚地探索组织的基因组信息。因此，在不受组织学边界限制的情况下进行空间基因组分析，可以为描绘肿瘤与临近良性组织的克隆结构提供重要见解。

研究策略

该研究涉及到前列腺、脑、淋巴结、乳腺、皮肤等多个器官的空间转录组数据，共120,000多个区域（图1）。通过聚焦于前列腺肿瘤组织与临近的良性组织的空间转录组，研究人员推断每个区域的拷贝数状态，描绘了前列腺组织的全器官克隆图谱，并解析克隆亚型与组织学分型的关系。此外，研究人员利用拷贝数变异进一步构建肿瘤克隆进化树，展示了空间层面的肿瘤发展。最后，研究人员通过多个器官的空间转录组数据验证前列腺组织的结果，并剖析多组织间的克隆异质性。

图1 空间转录组分析组织的拷贝数变异

研究成果

1. 拷贝数变异及其克隆进化结果的验证

为了验证通过inferCNV推断的拷贝数及根据其构建的克隆进化树是否准确，研究人员对具有DNA与RNA的单细胞数据进行分析。结果表明，使用inferCNV推断的CNVs可以反映基于DNA的系统发育结果，并且相应的克隆进化树与先前发表的结果相似（图2）。为了测试在空间数据中能否实现相应的拷贝数推断，研究人员开发了一个算法，从而模拟生成具有不同CNVs的组织及相应的空间数据。在模拟的数据中使用空间推断的CNV（siCNV）成功再现了拷贝数状态和克隆亚型，表明通过空间转录组能够实现空间层面的拷贝数推断并进行克隆进化分析。

图2 全基因组测序CNV与inferCNV克隆树的比较

2. 前列腺全器官的克隆景观

使用整个前列腺器官的横截面来探索常见恶性肿瘤的空间拷贝数状态。根据H&E染色和Gleason分级注释每个spot的组织学状态（图3a），而通过两个病理学家的手动注释可以对每个spot的病理状态进行评估（图3e，红圈表示含有50%的癌细胞，白圈表示含有50%的良性上皮细胞，黑圈表示单一细胞类型的比例小于50%）。基因表达的因子分析显示，组织学与基于marker基因注释的肿瘤、增生和良性上皮因子之间的重叠（图3b、3e）。同样，基于推测的拷贝数可发现大部分的组织区域都是拷贝数中性的，而某些区域的CNV活性增加，如V1_1、H2_1、H1_1等（图3c、3f）。这些初步结果表明，推断的拷贝数状态与相应的组织学以及基因表达有所不同。

图3 转录本和CNV状态的全器官空间测定

上述表明，某些注释为组织学良性的区域显示出CNV活性增加。因此，在后续推断CNV时将注释为组织学良性及缺乏CNV的spot作为参考集。CNV推断结果显示，相同Gleason分级的区域中存在不同的克隆亚型（图4a、4d、4e）。为了构建克隆树，研究人员假设（1）包含相同拷贝数特征的细胞群更有可能是相关的，而非偶然产生；（2）体细胞拷贝数事件是随着时间的推移依次获得。由此，该研究构建了一个系统发育树来描述序列克隆事件（图4a）。两个克隆（克隆A和B）缺乏关键的CNV事件，包括染色体16q和8p上的缺失，并且这两个克隆亚型在空间上主要聚焦在H1_2切片上。而大多数的克隆亚型位于Gleason第4分级的病灶周围（图4a~4c），因此研究将重点聚焦于这个主要区域（跨越H1_4、H1_5和H2_5切片）。这个区域可以观察到一个共同的祖先克隆（克隆H），包括6q和16q染色体上的拷贝数损失，以及12q和16q染色体上的拷贝数增加。这个克隆亚型明显位于主瘤灶内侧的Gleason第2分级区域（H1_4切片）和位于中上部边缘并被病理学家描述为“过渡区域”的区域（H2_5切片）。不同空间位置保守的CNV特征是值得关注的，一个可能的解释是克隆H代表前列腺癌克隆树分支形态的线性序列，并发生了进一步的体细胞事件，产生了克隆I、J和K，并形成了一个高级别肿瘤病灶（图4b）。

图4 癌症器官分析中的特定体细胞拷贝数变异

3. 跨越组织边界的体细胞克隆

鉴于上述结果显示细胞表型与推断的基因型不一致，因此，研究人员分析了前列腺左侧边缘区内含有大致相同比例癌症和良性组织的H2_1切片所有spot的拷贝数状态，并根据定义的聚类将该切片内的spots划分为克隆A至克隆G（图5a~5b）。在空间上，推测的克隆亚型与组织学亚型广泛相关，但仍有一些重要的区别（图5c~5d）。例如，许多CNV已经发生在良性组织中（克隆C），其中最明显的是在8号和10号染色体，这包括致癌基因MYC的扩增和抑癌基因PTEN的缺失。且在空间上该克隆由一个完全良性的组织构成，克隆树显示该区域从附近大部分拷贝数中性的克隆A和B分支出来。因而组织学良性的细胞存在体细胞突变事件，表明克隆亚群能够跨越组织学边界。

图5 癌症和良性前列腺上皮的体细胞突变

为了验证这种推断的拷贝数状态是否真正代表了潜在的基因型，研究人员用FISH探针靶向两个具有鉴别意义的特定基因，即MYC和PTEN。结果显示，在正常的良性组织（克隆A）中这两个基因是二倍体，而在改变的良性组织（克隆C）和肿瘤（克隆F）中，MYC扩增和PTEN缺失是明显的（图5e）。

鉴于上述结果，研究人员认为对推断的低级别癌症基因型的分析可能揭示与高级癌症的重要差异，并依上结果提出一个假设：部分低级别肿瘤因缺乏关键的体细胞突变事件而不能发展为高级别的肿瘤。

4. 多个组织中的克隆异质性

上述结果显示，前列腺癌内克隆的异质性以及良性前列腺组织也存在体细胞突变事件。研究人员将这一结果推广到多个器官中，以进一步验证不同组织中可能的克隆异质性，以及良性组织的体细胞突变事件。

首先，研究人员分析了一个良性淋巴结，可以观察到整个组织切片拷贝数中性的状态（图6a~6b）。随后，将良性鳞状上皮和鳞状细胞癌的皮肤组织纳入分析。两个关键的体细胞突变事件（染色体1号和12号部分区域扩增）在临近的完全由组织学良性组成的区域出现（图6c~6d），从而证实在其他癌症类型中肿瘤克隆能够突破组织边界；进一步通过DNA FISH验证了1q染色体扩增（CKS1B）、8q染色体缺失（MYC）和19q染色体缺失（EHD2）结果。同样，研究人员对小儿髓母细胞瘤、导管乳腺癌以及成人胶质母细胞瘤进行分析，发现小儿髓母细胞瘤的克隆类型均匀一致，但可以观察到关键的体细胞突变事件，如3q扩增、9q缺失等（图6e~6f）。总的来说，在五个分析的器官中，组织克隆的多样性明显不同，癌症和良性组织的基因组从同质性到高度异质性不等（图6g）。

图6 多组织中的体细胞拷贝数改变

 总   结 

本研究以前列腺癌为重点，借助空间转录组分析全器官的拷贝数状态，表明组织学上良性和恶性区域间可能存在的分子关系，即良性组织内可能出现恶性区域广泛存在的体细胞突变事件，相应的肿瘤克隆能跨越组织边界。总之，本研究以一个无偏倚途径来探索基因组完整性，为癌症分子病理学的研究提供了思路，同时也为改善临床重要癌症的早期检测、靶向和全身治疗，以及改善恶性肿瘤患者的预后提供了基础。

内容 | 刘晖

题图 | 彭卫

审校 | Lina

排版 | 小飞鱼

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