文献详解|一篇Front Oncol教你肿瘤单基因生信研究新招！
给你一个明确的基因A，让你从生信分析角度研究它与某一肿瘤B之间的关联性，你会怎么做？先从多个公共数据库中下载肿瘤B的数据，分析A在B中的表达情况，然后做下生存分析，再加个功能分析，搞定！额，还不错，简单明了！但这个思路想要发高分文章可不easy哦，内容有点过于单薄，如果是前几年还可以发个3分左右，但如今可不行了，需得好好充实下内容。那么如何充实？下面要介绍的是一篇今年7月份发表在“Front Oncol”（IF=4.848）上的文章“Comprehensive Analysis of the Immune Implication of ACK1 Gene in Non-small Cell Lung Cancer”，研究的就是单基因ACK1与非小细胞肺癌免疫浸润之间的关系，文章通过大量的生信分析构建了较高准确度的非小细胞肺癌预后模型以及nomogram模型。
一、背景介绍
肺癌是最常见的癌症，也是最致命的实体恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌的主要组织学类型，占全部病例的85%。尽管肺癌的治疗手段有了很大的改进，但患者预后仍差强人意。活化的CDC42激酶1（ACK1）是一种细胞内非受体酪氨酸激酶，ACK1是多种癌症的潜在治疗靶点，且已有研究表明ACK1参与调控多条免疫相关通路，但其在NSCLC中的免疫作用尚不清楚，有待进一步研究。
二、研究内容
1. 浸润性免疫细胞分析
研究人员首先利用CIBERSORT（CIBERSORT是研究免疫细胞浸润的一大利器，它能基于公共数据库中的基因表达谱来量化肿瘤样本和正常样本中免疫细胞的比例）对TCGA中肺腺癌(LUAD)和肺鳞癌(LUSC)（LUAD和LUSC是最常见的NSCLC类型，因此全文针对这两种类型分别进行了一系列的分析）的基因表达谱数据分别进行分析，计算22种免疫细胞类型的比例，结果显示相对于正常组织，肿瘤组织中的各免疫细胞比例有明显变化，且LUAD和LUSC的免疫浸润情况有差异。（免疫细胞比例有变化，表明其可能参与了肿瘤的发生发展，后续可以针对免疫浸润进行分析）
2. ACK1与免疫细胞的关系
NSCLC中免疫细胞发生了明显变化，那么，主角分子ACK1是否与这些免疫细胞变化相关呢？研究人员利用TIMER（TIMER是免疫浸润研究的另一大利器，可以直接利用TCGA数据进行免疫细胞浸润情况分析，其中的Gene模块，可以直接分析基因表达与免疫浸润丰度的关系，这对于肿瘤单基因免疫浸润分析可谓十分友好）分析了ACK1与6种免疫细胞之间的关系，结果显示LUAD和LUSC中这6种免疫细胞的浸润水平均与ACK1基因拷贝数密切相关。此外，LUSC中ACK1的mRNA水平与各免疫细胞浸润水平负相关，而LUAD中有正相关也有负相关。
为进一步确定肺癌中ACK1的功能，研究人员对ACK1敲减的细胞进行了测序分析，结果显示多个免疫相关通路被激活，这些结果进一步表明ACK1可能影响肺癌的免疫反应（想要更为详细的了解ACK1的功能，那么敲减或过表达处理，随后进行相应分析，说服力绝对加倍，这里研究人员自己做了测序实验，想必是因为数据库中没有相应的数据信息，只能自己做）。研究人员进一步对CCLE（CCLE即“癌细胞系百科全书”，收录了900多种人类癌细胞系的DNA突变、基因表达和染色体拷贝数等遗传信息）中的188个肺癌细胞系的测序数据进行了分析，并根据ACK1的表达水平将细胞系分为ACK1高表达组和ACK1低表达组，GSEA分析结果同样显示ACK1与多条免疫相关通路相关。（多方位多角度证明ACK1与免疫之间的相关性）
3. 构建ACK1相关免疫调制剂的预后模型
对LUAD中ACK1参与的免疫信号通路进行分析，利用 TISIDB（ TISIDB是一个肿瘤免疫相关数据的数据库，收录了大量与免疫相关的基因）分析发现20个免疫激活剂和15个免疫抑制剂与ACK1密切相关。此外，研究人员使用癌症基因组学的cBioPortal查询到了与这些免疫调节剂紧密相关的top 50基因，并对这50个基因进行了GO和KEGG富集分析，结果显示这些基因与免疫相关。
为了解LUAD中ACK1相关的免疫调节剂的预后价值，研究人员对这些基因进行了多因素Cox回归分析，获得了包含14个基因的预后模型，随后利用单因素Cox回归分析了这些基因与总生存期之间的关系，并计算风险值（risk scores），生存曲线分析结果显示低风险组LUAD患者预后更好。
与此同时，对LUSC进行了同样的分析，分析发现CAK1相关的35个免疫激活剂和19个免疫抑制剂，并构建了包含13个基因的预后模型。
4. 构建Nomogram模型
最后研究人员构建了一个包含风险值的LUAD预后nomogram模型（nomogram模型通过构建多因素回归模型，根据模型中各个影响因素对结局变量的贡献程度，给每个影响因素的每个取值水平进行赋分（points），然后再将各个评分相加得到总评分（total points），最后通过总评分与结局事件（3年或5年生存率）发生概率之间的函数转换关系，从而计算出该个体结局事件的预测值），该模型可以通过风险值、病理阶段、TNM分期和性别来预测患者的生存概率，该nomogram模型的c-index（c-index用于度量模型的区分能力，既往研究认为，C-index在0.71-0.90之间为中等准确度）高达0.71，表明该模型准确性较高。
文章从单基因CAK1出发，通过多个公共数据库的数据挖掘以及多款免疫浸润相关生信软件分析，对NSCLC两种重要亚型LUAD和LUSC中CAK1与免疫细胞浸润之间的关系进行了详细的分析，并因此构建了高准确度的预后模型和nomogram模型，为NSCLC临床个性化治疗提供新的策略。文章的分析思路清晰明了，如果你也想进行肿瘤单基因的免疫研究，那就赶紧学习起来吧~。