抗新型冠状病毒的单克隆抗体作用机制及其制剂研究进展

中和抗体是病原微生物侵入人体时B细胞产生的一类抗体，是靶向病原体并阻断病原体入侵细胞的特异性免疫球蛋白。针对新型冠状病毒(2019-nCoV)，中和抗体能够与病毒表面刺突蛋白(S蛋白)结合，阻断病毒入侵细胞。相比小分子药物和血浆疗法，中和抗体特异性和安全性更好，具有预防与治疗的双重作用，有望成为2019-nCoV的"特效药"。近来研究已发现能对抗2019-nCoV的强效单克隆抗体，国內外研究竞争相当激烈。但是主要集中在预防方面，而对这些治疗性抗体在人体内的疗效评估有限，因为还未发现一种与人类感染更相关的动物模型，可能需要多种动物模型来模拟人类感染的各种情况。现将抗2019-nCoV治疗性单克隆抗体的作用机制及其研究制剂最新进展进行介绍，以供参考。

1　治疗性抗2019-nCoV单克隆抗体的作用机制

1.1　2019-nCoV侵入宿主细胞的途径

2019-nCoV的S蛋白决定病毒的宿主范围和特异性，是单克隆中和抗体及疫苗设计的关键作用靶点。2019-nCoV的S蛋白类似螺丝钉，但头部更大，柄部也较细长，以三聚体的形态存在，主要包括3个S1头部亚基和1个三聚体S2亚基。其中S1亚基头部尖端含有受体结合域(RBD)，可以与人血管紧张素转化酶2(ACE2)受体结合，这种结合有助于病毒附着至靶细胞的表面。病毒进入宿主细胞过程中，除了ACE2，很可能还需要两种跨膜蛋白酶：即可以切割ACE2的跨膜金属蛋白酶-ADAM17以及参与ACE2和2019-nCoV膜融合过程的丝氨酸蛋白酶(TMPRSS2)。通过在S蛋白的S1/S2和S2'位点切割TMPRSS2，可激活S蛋白，并允许病毒膜和细胞膜融合，这一过程由S2亚基驱动(图1)。病毒进入宿主细胞通过RBD的基因重组或突变可以实现不同宿主间的传播，并导致较高致死率。在S1亚基，RBD与靶细胞上的ACE2受体结合后，S2亚基中的七肽重复域(HR)1和HR2相互作用，形成六螺旋束(6-HB)融合核心，使病毒更接近细胞膜，促进病毒膜和宿主细胞膜的融合和感染。Zhou等认为在2019-nCoV感染细胞过程中，其S蛋白的S2亚单位是介导病毒与细胞膜融合的主要病毒元件。2019-nCoV和严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)的S2亚单位具有89.8%的序列同一性和96.9%的序列相似性，且二者受体均为ACE2。不同的是，2019-nCoV的S蛋白S1亚单位中RBD与ACE2结合的亲和力比SARS-CoV高10～20倍，这可能是2019-nCoV感染性和传播性更强的主要原因。

空军军医大学陈志南团队首次发现第2条2019-nCoV入侵宿主细胞途径，即S蛋白与宿主细胞上的受体CD147结合，从而介导2019-nCoV入侵宿主细胞。早期广泛报道ACE2是2019-nCoV进入宿主细胞的受体，类似于SARS-CoV。然而最近研究表明，另外两种受体，葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和CD147也可能参与其中。CD147是宿主细胞表面的一种跨膜糖蛋白，被认为是感染的替代途径。此外，一项计算机研究预测S蛋白与GRP78的结合。GRP78属细胞中70 kDa热休克蛋白(HSP70)家族，是内质网功能的核心调节因子。Wang等体外研究也表明，2019-nCoV感染细胞是通过S蛋白与CD147的结合而感染，成为另一条侵入人体的途径。CD147又称为碱性蛋白(BSG)或细胞外基质金属蛋白酶诱导剂(EMMPRIN)，是一种属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白。其主要在肺组织的几种细胞类型表达，如上皮细胞、巨噬细胞和纤维化区域边缘的Ⅱ型肺泡细胞。有一种脂肽类物质-EK1C4可对抗2019-nCoV的S蛋白介导的膜融合过程，可能成为有效膜融合抑制剂。

研究者还发现，人源化抗CD147抗体美普珠单抗(Meplazumab)可通过阻断CD147来有效抑制病毒入侵宿主细胞，并在临床前研究和临床管理中均显示出良好的安全性。因此，该途径为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)治疗中的特定抗病毒药物开发提供了良好的新靶标。初步研究发现，美普珠单抗治疗COVID-19患者安全有效。

1.2　2019-nCoV的S蛋白逃逸突变与单克隆抗体作用的相关性

众所周知，RNA病毒会随着时间的推移而积累突变，任何抗病毒治疗的一个重要关注点是可能选择治疗诱导的逃逸突变体。Baum等^[9]研究了针对4种抗2019-nCoV的S蛋白抗体的耐药性，无论是单独还是与鸡尾酒疗法混合使用，这些抗体仍能有效中和2019-nCoV，对人体出现的刺突变体仍然有效，如能选择两种结合独特的非重叠病毒靶标区域(S蛋白的RBD)靶向2019-nCoV的S蛋白的抗体组合，可阻止治疗时产生的逃逸突变。

世界卫生组织(WHO)表示，从2020年1月至今，2019-nCoV已出现4种主要病毒变异体。(1)首先是D614G变异毒株，感染此变异毒株患者携带的病毒量更高，这证明其传染性变得更强，到2020年6月，该变异体已成为全球主要传播的新病毒类型。(2)2020年8至9月，丹麦发现与水貂相关的2019-nCoV变异毒株，仅在9月发现了12例相关确诊病例，不过该变异病毒似乎并未大范围传播。(3)2020年12月14日，英国向WHO通报出现新的B.1.1.7病毒株(又称VUI-202012/01)，该毒株有14个突变点，其中7个发生在2019-nCoV感染细胞的S蛋白上，发生了N501Y突变，即501位置的天冬酰胺(N)变为络氨酸(Y)。WHO于12月21日宣布，这种变异2019-nCoV已在澳大利亚、丹麦、意大利、冰岛和荷兰等国被发现，其传播力比此前的病毒株高出70%，目前英国至少有半数病例都是源于这支新毒株。B.1.1.7病毒株虽然传播力惊人，但其导致的病情严重程度与再感染情况并没有出现变化，现阶段的治疗与检验方法都不会受到影响。(4)2020年12月18日，南非也发现了突变毒株501.V2，并造成了第二波疫情暴发，且确诊病例呈指数级增长。临床数据显示，这些确诊者多数为年轻人。WHO强调，B.1.1.7病毒株和突变毒株501.V2都存在N501Y突变，是感染人体细胞的关键，导致病毒传播快速。截至12月30日，除南非以外，已有4个国家发现了突变毒株501.V2确诊病例。但是，这些变种毒株尚未发现会影响特异性单克隆中和抗体的抗病毒作用。

2020年10月，印度首次发现2019-nCoV突变株B.1.617，显然是印度疫情失控的一个影响因素。但迄今为止，WHO尚未将该变异株列入"忧虑变种"(Variants of concern)。美国发现的B.1.427和B.1.429型及日本和巴西发现的P.1型。目前情况分析，英国的B.1.1.7型变异毒株正在呈下降趋势，而被印度发现的B.1.617毒株及其子变异种(B.1.617.1、B.1.617.2和B.1.617.3)正在呈上升趋势。2021年2月，美国科贝尔(Bette Korber)首次发现1例英国B.1.1.7与美国加州变异株B.1.429基因重组而成为"合体病毒(B.1.1.7+B.1.429)"，即N501Y变异(传播加速)与L452R变异(逃脱疫苗抗体)结合成一个严重突变的混合体，这种合体病毒每次可以会多重突变。这种病毒的出现是否具有较高的传染性，或易引发重症或难以被免疫抗体中和的可能性，尚需研究。

2　国内外研发2019-nCoV单克隆抗体的临床试验概况

全球有数百个2019-nCoV抗体研发项目正在进行研究，其中对其有效性、安全性较为肯定的共有12个中和抗体项目进入临床试验，包括：美国再生元(Regeneron)公司开发的REGN-COV2抗体鸡尾酒疗法；美国礼来(Lilly)公司和加拿大AbCellera公司联合开发的LY-CoV555(Bamlanivimab)；美国Vir Biotechnology(VIR)公司联合英国葛兰素史克公司开发的VIR-7831(2020年8月底进入临床Ⅱ/Ⅲ期试验)和VIR-7832(将于2021年第1季度进入1b/2a期临床试验)；英国阿斯利康(AstraZeneca)公司正计划启动AZD7442(LAAB)的2项Ⅲ期临床试验；新加坡Tychan公司的Ty027和韩国Celtrion公司的CT-P59研发项目；中国科学院微生物研究所和上海君实生物医药科技股份有限公司(君实生物)合作开发的重组全人源抗新冠病毒单克隆抗体注射液(JS016)；迈威(上海)生物科技股份有限公司(迈盛生物)的MW33、腾盛博药医药技术(北京)有限公司(腾盛博药)的BRII-196/198、神州细胞工程有限公司(神州细胞)的SCTA01及上海复星医药(集团)股份有限公司(复星医药)的HLX70均已进入临床试验阶段，详见表1。其中REGN-COV2抗体鸡尾酒、LY-CoV555、VIR-7831/VIR-7832、JS016、AZD7442(LAAB)及美珀珠单抗最引发人们关注。

2.1　REGN-COV2抗体鸡尾酒

REGN-COV2由REGN10987和REGN10933抗体组成，是再生元公司开发的用于预防和治疗COVID-19的研究性双抗体鸡尾酒疗法。REGN-COV2临床试验由4组不同的研究人群组成：住院的COVID-19患者、非住院有症状的COVID-19患者、高危暴露人群中的未感染人群(如医护人员)和密切暴露于COVID-19患者的未感染人群(如患者的室友)。前两组研究人群适应性Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期研究正在评估REGN-COV2治疗住院和非住院COVID-19患者的安全性和有效性。Ⅰ期研究将关注病毒学和安全性终点，Ⅱ期研究将关注病毒学和临床终点。Ⅰ期和Ⅱ期研究数据将用于细化终点并确定Ⅲ期研究的规模。2020年9月14日，再生元公司与英国牛津大学将开展Ⅲ期临床研究(RECOVERY)，主要评估REGN-COV2对COVID-19患者的病死率、住院时间和通风需求的影响。Ⅲ期研究数据显示，REGN-COV2减少了患者的病毒载量，并减轻了非住院COVID-19患者的症状，在减少患者就医上也显示出积极的信号。

REGN-COV2组成抗体REGN10987和REGN10933是从VelocImmune转基因小鼠和COVID-19康复者血液中分离得到的全人源中和抗体，根据结合特性、中和特性以及三维结构表征高通量筛选而得。REGN10987和REGN10933非竞争性与2019-nCoV的S蛋白RBD结合，完美屏蔽了RBD与ACE2的结合界面，从而削弱了病毒因突变造成的逃逸。临床前研究表明，REGN-COV2可以减少在恒河猴(模拟轻度疾病)和金色仓鼠(模拟更严重疾病)非人类灵长类动物肺部病毒的载量和相关损伤；当在恒河猴中给药时，REGN-COV2可明显降低下呼吸道和上呼吸道的病毒载量，并减少病毒引起的病理性疱疹；同样，仓鼠给药可限制体质量减轻，并降低肺部病毒滴度和肺炎。这些结果表明，该抗体混合物具有治疗COVID-19的潜力。

2.2　LY-CoV555与LY-CoV555/LY-CoV016

礼来和AbCellera公司联合开发的中和抗体LY-CoV555已进入预防和治疗临床试验阶段。BLAZE-1单药治疗队列Ⅱ期临床研究中，452例轻度或中度COVID-19门诊患者接受单次静脉注射中和抗体LY-CoV555，与安慰剂组患者相比，临床获益较低。2020年11月9日，美国食品药品监督管理局(FDA)仍授权礼来公司研发LY-CoV555的紧急使用权；700 mg的LY-CoV555将通过单次静脉注射，被允许用于成人患者以及12岁以上的轻、中度2019-nCoV感染者。

礼来公司宣布最新Ⅱ期临床试验结果，由LY-CoV555和LY-CoV016(JS016)两种靶向2019-nCoV的S蛋白中和抗体构成的组合疗法(每种抗体各给药2 800 mg)，在治疗轻度和中度COVID-19患者时，可显著降低患者病毒载量、疾病症状以及与COVID-19相关的住院和急诊治疗风险。

值得注意的是，LY-CoV555/LY-CoV016抗体组合疗法在用药第7天可极大地减少病毒载量，能够更好地避免对抗体疗法产生耐药性的变异病毒株的产生。在接受组合疗法治疗的患者中，检测到的潜在耐药变异<1%，而安慰剂组和中和抗体单药治疗组的这一数值分别为7%和9%。此外，单药治疗组和组合疗法组均未报告药物相关的严重不良事件，其他不良反应均与安慰剂组相当。

2.3　VIR-7831和VIR-7832

VIR和葛兰素史克公司开发出两种候选抗2019-nCoV单克隆中和抗体VIR-7831和VIR-7832。VIR-7831在临床前研究中显示对2019-nCoV的S蛋白具有亲合力，并且表现出较强的病毒中和能力。目前，这两家公司与上海药明生物技术有限公司合作VIR-7831(又称GSK4182136)，已经于2020年8月底进入Ⅱ/Ⅲ期临床试验，并对抗体Fc端进行优化，增强其激活巨噬细胞和自然杀伤细胞的能力。这项名为COMET-ICE的Ⅱ/Ⅲ期临床试验预计注册近1 300例早期COVID-19患者，其目的是评估单剂VIR-7831注射能否预防COVID-19导致的住院，预计将在2021年第一季度获得完整结果。VIR公司研发管线中的VIR-7832抗体是一款针对2019-nCoV的中和抗体，对其工程化改造不但延长其半衰期，而且提高其在肺部的生物利用度。对Fc端的优化改造使其不但可能成为COVID-19的疗法，还可能成为预防性T细胞疫苗，预计将于2020年下半年进入临床试验。这些发现强调了当IgG抗体选择性地激活树突状细胞-T细胞途径，增强树突状细胞成熟和诱导保护性CD8⁺ T细胞反应，导致预防或治疗致死性病毒呼吸道感染的增强效果。他们诱导对病毒感染的保护性、适应性免疫的能力，这对开发具有改善抗病毒功效的抗体治疗剂以对抗病毒呼吸道病原体具有重要意义。

2.4　JS016

君实生物研发的JS016是国内第1个、全球第2个进入临床试验的2019-nCoV重组全人源单克隆中和抗体疗法。Ⅰ期临床试验数据显示，JS016的安全性和耐受性良好。目前正在中国和周边国家开展治疗COVID-19患者的Ⅰb/Ⅱ期临床试验研究。

中国科学院微生物研究所从康复患者中筛选出2株2019-nCoV单克隆抗体：CA1、CB6。其中CB6-LALA即JS016单克隆抗体，有更强的中和活性，并在Fc段引入L234A、L235A(LALA突变)，去除ADCC效应，以避免抗体依赖增强(ADE)效应导致的急性呼吸道损伤和急性呼吸窘迫综合征等。恒河猴感染试验中，CB6-LALA具有治疗作用和预防作用，显著减少肺部损伤，对于抗2019-nCoV具有重要意义。当然，从进入临床研究到最终上市，还要完成Ⅲ期临床试验阶段。

2.5　AZD7442

AZD7442是由从2019-nCoV感染后恢复期患者体内发现的两种中和抗体(AZD8895和AZ1061)组合而成，都是针对病毒的S蛋白RBD。由美国范德堡大学医学中心发现，并于2020年6月授权给阿斯利康公司。对AZD8895和AZ1061进行优化，延长抗体半衰期，并减少其与Fc受体的结合，单次给药后可将疗法的持久性提高到6～12个月，是一种长效抗体。这款中和抗体在临床前试验中已被证明可阻断2019-nCoV与宿主细胞的结合，并在细胞和动物疾病模型中针对感染起保护作用。阿斯利康公司宣布AZD7442研究将在两项Ⅲ期临床试验中接受评估，一项试验将在约5 000例受试者中评估AZD7442预防感染长达12个月的安全性和有效性，另一项试验将在约1 100例受试者中评估暴露后预防治疗的效果。AZD7442组合疗法有可能作为疫苗的一种补充性制剂，如对于不适合接种疫苗的人群或为高危人群提供额外保护，也可用于治疗2019-nCoV感染者。

2.6　美普珠单抗

2020年3月24日，空军军医大学陈志南等研究发现，人源化抗CD147抗体美普珠单抗治疗COVID-19肺炎患者安全有效(该单克隆抗体既往一直被应用于抗疟疾的研究)。该研究招募了28例COVID-19患者，其中17例为美普珠单抗组，11例住院患者为对照组。与对照组相比，美普珠单抗可显著改善COVID-19危重和重症患者的出院率和病情严重度。美普珠单抗组患者病毒阴性时间明显早于对照组，恢复至正常淋巴细胞计数和C反应蛋白浓度的患者比例也高于对照组。在应用美普珠单抗治疗的患者中未发现不良反应。

3　小结

COVID-19已形成全球大流行，研究人员正从包括小分子抗病毒药物、康复者血浆治疗、疫苗及中和抗体等方面开展积极的研究治疗和预防干预措施。在临床抢救危重患者中发现，康复者血浆中具有中和活性的抗体，在疾病治疗上起到重要作用。但血浆来源有限，无法大规模应用于临床，而具有中和活性的单克隆抗体具有靶点明确、纯度高以及可大规模制备等优势，并且已有多种单克隆抗体制剂用于病毒性传染病防治的经验。因此，单克隆抗体或可成为对抗2019-nCoV的有力武器。从研究者和各大制药公司发表的Ⅱ、Ⅲ期临床试验结果以及批准"同情使用"的抗2019-nCoV单克隆中和抗体制剂治疗效果的观察，显示出其在抢救危重患者具有独特的疗效，尤其是由两种或以上组合的鸡尾酒疗法更为明显。虽然病毒S蛋白变异逃逸，但仍未证明影响单克隆中和抗体制剂的抑制作用。我国JS016、BRII-196、BRIII-198、MW33、SCTA01和HLX70的研制进展迅速，均已进入临床试验阶段，具有巨大的发展潜力。