流感病毒免疫逃逸机制研究进展
流感病毒免疫逃逸机制研究进展
流感是一种由流感病毒感染引发的急性呼吸道传染病。流感病毒为单股负链多节段包膜RNA病毒，每个基因组节段核苷酸长度在890～2 341 bp之间，属正粘病毒科。流感病毒粒子呈球状，新分离的毒株则呈丝状等多形性，直径80～120 nm。病毒外层是脂质双分子囊膜，上嵌血凝素(hemagglutinin, HA)、神经氨酸酶(neuraminidase, NA)以及基质蛋白2(matrix protein 2, M2)3种蛋白。HA负责病毒与易感细胞表面受体结合，介导病毒膜融合侵入细胞。NA具有唾液酸酶活性，与唾液酸底物反应从细胞中释放病毒颗粒。流感病毒包括甲型、乙型、丙型和丁型。甲型和乙型流感病毒是人类及动物最常见的病原体，同时也是造成季节性流感的主要原因。基于HA和NA的抗原性，甲型流感病毒可分为18个H亚型(H1～H18)和11个N亚型(N1～N11)。通常，流感病毒名称还包括流感病毒型别和亚型、宿主类型、分离地区、分离序号以及分离年份，例如2009年从美国加利福尼亚州患者中分离得到的H1N1病毒株命名为A/California/07/2009 (H1N1)。
作为全球最严重的健康威胁之一，季节性流感流行每年造成约300～500万严重病例，导致约29～65万例与呼吸道疾病相关的死亡。甲型流感在历史上曾引起过多次全球性流感大暴发，例如1918年由H1N1亚型流感病毒引起的"西班牙流感"，导致2 000～5 000万人死亡；1957年由H2N2亚型引起的"亚洲流感"；1968年由H3N2引起的"香港流感"；2009年由猪源H1N1亚型引起的全球流感大暴发，蔓延200余个国家。
流感病毒频繁引起季节性流行或世界性大流行的重要原因之一，在于其特殊的免疫逃逸机制：一方面是由于流感病毒通过频繁的不同亚型基因片段重配和快速的抗原变异，逃避宿主免疫识别，从而导致季节性或流感大流行暴发，威胁人类的健康；另一方面，流感病毒在与宿主相互作用及共同进化中，通过多种机制越过宿主免疫屏障或逃避宿主免疫清除，实现有效感染。因此，了解宿主抗流感病毒免疫如何形成，以及流感病毒如何逃避宿主免疫反应非常重要，对于有效监测流感病毒变异、研发抗流感新药物和防控流感流行具有重要意义。
1 流感病毒感染与免疫机制
1.1 流感病毒感染机制
流感病毒主要通过飞沫在宿主之间传播。流感病毒进入宿主呼吸道后，通过HA与宿主气管上皮细胞表面唾液酸α-2-3或唾液酸α-2-6受体结合，吸附至细胞表面，以内吞的形式侵入细胞。在细胞内病毒与内涵体融合形成吞噬体，随着pH的降低，内容物缓慢释放，当pH降低至阈值时，被M2终止，此过程称为脱壳。脱壳后，病毒核糖核蛋白(viral ribonucleoproteins, vRNPs)迅速从细胞质转移至细胞核进行复制与转录。新生成的子代病毒的核酸与核蛋白(nucleoprotein, NP)、碱性聚合酶1(basic polymerase 1, PB1)、碱性聚合酶2(basic polymerase 2, PB2)、酸性聚合酶(acidic polymerase, PA)相互作用生成大量vRNPs。vRNPs进一步结合病毒基质蛋白1(matrix protein 1, M1)，通过后者直接与含有核输出信号(nuclear export signal, NES)的核输出蛋白(nuclear export protein, NEP)结合，在宿主染色体区域稳定蛋白1(chromosome region maintenance 1, CRM1)介导下，从细胞核转移至细胞质，参与病毒的包装。vRNPs与细胞膜脂质双分子层上的HA、NA和M2结合，当修饰好的病毒蛋白聚集至一定浓度时与M1聚合浓缩，在细胞膜上组装成新病毒颗粒，通过NA的作用，裂解脱落释放，完成出芽增殖。
1.2 宿主抗流感病毒免疫机制
1.2.1 宿主抗流感病毒天然免疫机制：
流感病毒进入呼吸道后，呼吸道上皮细胞识别病毒并启动免疫反应，第一道防线为先天免疫应答，其反应迅速，但缺乏特异性以及记忆力。流感病毒感染宿主细胞后，模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)启动抗病毒联级反应，导致干扰素(interferon, IFN)、细胞因子和趋化因子产生。其中参与流感病毒感染识别的PRRs主要有：Toll样受体(toll-like receptors, TLRs)、RIG-I样受体(RIG-I-like receptors, RLRs)、NOD样受体(NOD-like receptors, NLRs)。
TLRs是第一时间识别流感病毒的受体，主要有TLR3、TLR7/8、TLR4。TLR3可识别流感病毒复制和转录过程中产生的dsRNA，通过IFN-β TIR结构域衔接蛋白(TRIF)依赖的信号通路，促进IFN-β的转录、翻译和分泌。TLR7/8可识别流感病毒进入胞内后的ssRNA，通过MyD88依赖的信号通路激活NF-κB或干扰素调控因子IRF7，促进多种炎症细胞因子和IFN-α的表达。TLR4是否可识别流感病毒表面蛋白尚未明确，但病毒感染肺组织可产生氧化磷脂，后者可能激活TLR4的MyD88依赖和TRIF依赖两条信号通路，诱导炎症反应和肺损伤[9]。RLRs是细胞质中一类RNA解旋酶，可识别外源病毒RNA，在感染的细胞中激活RLRs及下游信号分子，诱导Ⅰ型IFN产生或激活IRF3和NF-κB诱导其他炎症细胞因子，从而发挥抗病毒免疫作用。NLRs是一种重要的细胞内PRRs，其特征在于存在保守的NOD基序。在病毒感染过程中，某些NLRs家族成员通过形成炎症小体来调节宿主先天免疫。流感病毒M2离子通道中质子改变导致NLRP3炎症小体活化。与此同时流感病毒毒力蛋白PB1-F2的高分子聚集同样可能激活NLRP3炎症小体，从而启动以炎症小体介导的信号通路，最终诱导促炎细胞因子IL-1β以及IL-18产生。
在病毒感染期间，还有多种免疫细胞，如巨噬细胞、自然杀伤细胞(natural killer cells, NK cells)参与宿主的天然免疫。在感染初期，肺上皮细胞通过表达趋化因子CCL2分子，结合肺巨噬细胞和单核细胞表面趋化因子受体CCR2，活化巨噬细胞，增强IL-6和TNF-α等炎症因子反应；肺泡巨噬细胞还可通过吞噬凋亡作用，限制流感病毒的传播。NK细胞表面唾液酸化NKp44和NKp46受体可结合并直接裂解表达流感病毒HA的感染细胞；还可通过其表面CD16受体，结合附着在流感病毒感染细胞表面抗体的Fc区，通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)间接裂解感染细胞。
1.2.2 宿主抗流感病毒适应性免疫机制：
宿主对流感病毒的第二道防线是适应性免疫，包括体液免疫和细胞免疫。流感病毒感染主要产生抗HA、NA、以及基质蛋白(matrix protein, MP)和NP抗体。其中，HA抗体是主要的中和抗体，其可封闭病毒表面HA，阻断流感病毒对宿主细胞的附着、内吞或者病毒的释放等过程。NA抗体并不能中和病毒的感染，主要通过抑制NA的活性，干扰病毒出芽释放。此外，NA抗体和M2抗体也参与ADCC过程，发挥清除病毒的作用。在细胞免疫中，流感病毒抗原通过主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)Ⅱ类分子呈递给CD4＋T细胞，后者激活分化为Th1和Th2细胞。Th1细胞表达IFN-γ和IL-2，促进机体细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)的增殖和分化，Th2表达IL-4、IL-5和IL-13，激活B细胞分化，产生特异性抗流感病毒抗体。被流感病毒感染的树突细胞产生的内源性抗原通过MHC Ⅰ类分子呈递给CD8＋T细胞，激活分化为流感病毒特异性CTLs，后者迁移至感染部位，识别并清除感染细胞。流感病毒特异性CTLs主要靶向相对保守的病毒内部蛋白，因此对不同亚型流感病毒具有较高的交叉活性。自病毒感染后，机体诱导产生CD4＋T记忆细胞和长效的CD8＋T记忆细胞，在流感二次感染时迅速诱导抗病毒免疫反应，抑制流感病毒的二次感染。
2 流感病毒免疫逃逸机制
2.1 逃避宿主先天免疫应答
2.1.1 抑制宿主产生IFN：
流感病毒通过不同的策略抑制IFN的生成，从而达到逃避宿主天然免疫的目的。非结构蛋白1(non-structural protein 1, NS1)在流感病毒感染过程中通过多种机制减弱IFN应答，是病毒编码的最重要的IFN拮抗蛋白。该蛋白在感染细胞的细胞质和细胞核中高度表达，能够与IFN诱导通路中涉及的不同分子相互作用。在流感病毒感染过程中，宿主细胞通过PRRs识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMPs)，启动抗病毒信号级联反应，流感病毒PAMP主要是5′末端含有三磷酸基团的病毒dsRNA。NS1可利用其RNA结合区与PAMP竞争性结合抑制RIG-I信号通路的激活，从而抑制IFN-β启动子的转录及翻译。宿主细胞中存在一类由RING锌指结构域、B-box和卷曲螺旋结构域而构成的三结构域蛋白家族(tripartite motif, TRIM)，参与细胞周期进程以及抗病毒反应。TRIM25的RING结构域具有E3泛素连接酶活性，在流感病毒感染过程中，NS1通过与TRIM25的E3泛素连接酶结构域互相作用，抑制TRIM25寡聚化，从而阻止RIG-I的K63泛素化，阻断RIG-I-MAVS信号复合体的形成，有效抑制RIG-I介导的IFN的产生，实现对RIG-I信号通路的负调控。现有研究表明，感染早期进入宿主细胞的vRNPs通过PB1/PA拮抗I型IFN产生。PB1(398E/524S/563I)和PA(351E)等关键氨基酸基序与RIG-I受体直接结合，抑制RIG-I介导的I型IFN信号通路。
2.1.2 下调宿主细胞基因表达：
流感病毒感染宿主细胞的过程中，可利用自身携带的蛋白质直接或通过与宿主蛋白互作间接调节宿主细胞基因表达，影响宿主的免疫应答反应。研究表明，在感染过程中调节宿主基因表达主要涉及3种病毒蛋白：PA-X、RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)和NS1。
PA-X是一种与流感病毒PA相同基因片段编码的病毒蛋白，与PA共享相同的N末端191个氨基酸，但具有不同的C末端结构域—通常被称为X-ORF。这种结构是在翻译中核糖体在PA基因mRNA中特定的核苷酸序列处UCC UUU CGU C发生1位移码突变成为UCC UUC GUC A。这种移码突变发生概率很小，因此感染细胞中PA-X表达量有限，但其仍能显著影响宿主的基因表达水平，抑制宿主抗病毒作用以及免疫应答。PA-X调节宿主基因表达的确切机制目前仍不清楚。一般认为，PA与PA-X所共有N末端结构域均含有典型的降解酶的PD(D/E)-XK折叠结构，具有核酸酶活性，而PA-X特异的C段能够使其在宿主细胞核以及细胞质中选择性降解宿主mRNA，从而抑制宿主基因表达。RdRp是流感病毒感染宿主细胞的过程中合成的一种异源三聚体，由PB1、PB2和PA组成。RdRp通过靶向结合宿主细胞RNA聚合酶II羧基端结构域，抑制其介导的转录延伸，导致宿主细胞转录失调。此外，流感病毒NS1对于抑制宿主细胞蛋白质合成也有着极为重要的作用。NS1的效应结构域与细胞裂解和多腺苷酸化因子30(cleavage and polyadenylation specificity factor 30，CPSF)相互作用，而CPSF30在转录过程中识别宿主mRNA 3′端的聚腺苷酸化信号，裂解宿主RNA并结合poly A聚合酶增加poly A尾，因此NS1能够抑制mRNA 3′端的聚腺苷酸化以及阻断细胞mRNA从细胞核中输出，最终抑制宿主细胞基因表达。
2.1.3 抑制宿主免疫细胞：
NK细胞在防御流感病毒中起着至关重要的作用，其表达的NKp46受体特异性识别流感病毒HA，使其可以特异靶向杀死感染病毒的细胞。因此，频繁的HA突变会导致病毒可能逃避NK细胞识别。此外，研究发现1999年至2003年分离出的人H3N2流感病毒感染细胞的NK细胞裂解效率低于1969年至1996年分离出的病毒感染细胞，这是因为新近病毒的HA中获得了2个新的糖基化修饰位点，影响NK细胞对病毒的识别，进而抑制NK细胞的清除作用。有意思的是，HA必须在受感染的靶细胞表面或游离病毒粒子表面充分表达，才能与NK细胞发生有效的相互作用。因此HA水平会影响NK细胞的NKp46和NKp44受体与HA的结合。在病毒感染早期与晚期HA处于低水平状态，从而逃避NK细胞识别。此外，在流感病毒早期感染时，受感染上皮细胞产生的趋化因子CCL2通过其受体吸引肺泡巨噬细胞和单核细胞，进而削弱单核细胞分化巨噬细胞的能力。流感病毒NS1可以通过影响编码MIP-1β、IL-12 p35、IL-23 p19、RANTES、IL-8、IFN-α/β和趋化因子受体CCR7的基因，特异性地抑制了DC成熟，迁移和T细胞刺激活性基础的遗传程序，从而间接影响病毒特异性CD8＋T细胞的免疫应答。
2.1.4 调节宿主细胞凋亡：
当流感病毒在宿主细胞中复制时，宿主诱导感染细胞凋亡是一种有效的抗病毒机制，能有效抑制病毒扩散。流感病毒可以通过更快的复制速度来间接逃避细胞凋亡的抗病毒作用，研究发现，流感病毒的NS1在其羧基端包含一个四氨基酸基序(PDZ-binding motif，PBM)。PBMs与具有促凋亡作用的细胞蛋白Scribble PDZ结构域结合，使得病毒以接近4倍的速度进行复制。同时，在受感染的细胞中，NS1与PBMs重新定位成胞质点状，并集中在核周区域，从而减少细胞凋亡。研究表明，流感病毒抑制宿主细胞凋亡与NS1有关。NS1与PI3KⅠ的p85β结合，激活宿主蛋白激酶AKT，抑制宿主细胞凋亡。
在病毒感染复制的后期，流感病毒通过促进宿主细胞凋亡，增强病毒释放，增加病毒的侵袭能力。此外，刺激细胞凋亡会减少细胞介导的毒性反应。研究表明，该机制与PB1-F2有关。PB1-F2是由PB1基因内的替代(＋1)阅读框编码的87个氨基酸的蛋白质，其定位于线粒体内膜，诱导膜内非特异性孔的形成，导致外膜的通透性增强，进而破坏线粒体造成细胞凋亡。PB1-F2C段与腺嘌呤核苷酸转运蛋白3(adenine nucleotide translocator 3, ANT3)及电压依赖性阴离子通道蛋白1(voltage dependent anion channel 1, VDAC1)相互作用，导致线粒体膜电位下降，形成凋亡小孔，活化Caspase级联反应，从而促进感染细胞的凋亡。
2.2 逃避宿主适应性免疫应答
流感病毒HA是体液免疫反应的主要靶标。HA是由HA1链和HA2链组成的三聚体，分为头部结构域和茎部结构域：头部结构域由HA1组成，含有受体结合位点和抗原决定簇，用于结合宿主细胞表面糖链受体；茎部结构域由HA2和部分HA1组成，主要起固定病毒的作用。头部结构域存在多个高度可变免疫优势抗原位点，唾液酸受体结合位点位于免疫优势抗原位点之间，通过改变HA受体结合亲和力可以改变病毒适应性。由于流感病毒缺乏校对活性，病毒RNA聚合酶对病毒RNA转录易于出错并导致核苷酸错误加入，因此在基因组中形成具有随机突变的病毒种。这导致宿主免疫压力下头部结构域HA1抗原位点不断变异，这种现象称为抗原漂移。同时，在头部结构域内添加N-糖基化位点会降低受体的亲和力。与抗原漂移不同，抗原转变可使病毒抗原性变化更为显著，例如不同亚型流感病毒通过共感染同一动物并发生重配，在新的人群或其他宿主动物中引入新的流感病毒亚型，宿主缺少特异靶向的中和抗体，因此更容易出现大范围流感暴发。
NA是由4个相同亚基组成的蘑菇状四聚体跨膜糖蛋白，由4个结构域组成：胞质尾结构域，疏水性跨膜结构域，茎和包含酶活性位点的球形头部。酶活性位点位于每个亚基的中心。NA抗体结合靶点大多位于围绕酶活性位点的表面环上。同时，NA茎的长度决定着球状结构域的高度，影响其与底物的结合。通过酶活性和茎结构域相应位点的突变，病毒可以逃避宿主对NA活性的抑制，确保病毒能够自感染细胞表面出芽生殖。此外，NA与HA在病毒表面空间上的可及性也相互影响功能，使得彼此受双方特异性抗体影响，呈现抗原漂移共进化实现病毒免疫逃逸的特点。宿主抵抗病毒的适应性免疫反应中，病毒特异性CTL对于消除病毒感染的细胞也是必不可少的。流感病毒通过其高突变率以及宿主HLA限制性的CTL选择压力来逃避T细胞的识别。有研究发现，在流感病毒NP的CTL表位区域处于选择压力之下，比其余部位有更多的非同义突变。CTL表位突变以不同的方式影响表位抗原肽呈递，一是锚定残基处氨基酸取代可导致表位完全丧失，因此抗原肽不再与MHC Ⅰ类分子结合；二是T细胞受体(T cell receptor，TCL)接触突变残基可以影响TCL识别特性。
3 结语
流感病毒是对人类健康威胁最严重的病原之一。由于流感病毒的快速变异及其对宿主免疫的逃逸，导致难以准确预测流感病毒流行株，也难以研制特异的疫苗来阻止流感全球性大流行的暴发。
本文对流感病毒针对宿主的先天免疫以及适应性免疫的逃逸机制进行了论述。在流感病毒感染宿主的过程中，宿主抵御病毒的免疫机制复杂多样，病毒逃避免疫应答的策略也复杂多变，仍有很多机制尚未阐明。例如流感病毒NS1有拮抗宿主IFN生成、抑制宿主表达和诱导凋亡等多种机制；流感病毒微量PA-X介导的宿主细胞基因表达调控机制也并不明确。只有深入了解流感病毒免疫逃逸机理及其致病机制以及其突变规律，才能有效监控流感病毒变异风险，研发流感疫苗与药物，科学应对流感流行。
引用: 黄梦婷, 张森, 李靖, 等. 流感病毒免疫逃逸机制研究进展 [J] . 中华实验和临床病毒学杂志,2020,34 (06): 671-676.
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