肺孢子菌肺炎的诊断方法及研究进展

引用：Marjorie Bateman, Rita Oladele, Jay K Kolls, Diagnosing Pneumocystis jirovecii pneumonia: A review of current methods and novel approaches, Medical Mycology, Volume 58, Issue 8, Novermber 2020, Pages 1015–1028, https://doi.org/10.1093/mmy/myaa024

2020年5月《Medical Mycology》刊登了Marjorie Bateman等的一篇关于目前肺孢子菌肺炎（简称PCP）诊断方法及进展（Diagnosing Pneumocystis jirovecii pneumonia：A review of current methods and novel approaches ）的综述文章^[1]。

该文作者通过Pubmed收集整理了100篇关于PCP检测方法以及对比不同样本类型的诊断结果的文章。作者认为，传统的肺泡灌洗液（brochoalveolar lavage fluid, BALF）染色镜检来诊断PCP，既不灵敏又不安全；而近年来的分子诊断技术（包括PCR、LAMP等）的发展和应用，有希望解决这些问题。分子诊断技术非常灵敏，可以通过无创获取的样本，如：痰、口腔冲洗液、鼻咽部抽吸物来诊断PCP。最后，作者认为，高水平的研究和临床医生教育是改善PCP诊断的关键，并最终改善患者的诊疗结果。

本软文摘录作者的部分数据和观点，将从耶氏肺孢子菌的临床特征、PCP检测常见标本类型、传统PCP检测方法、新型PCP检测方法、面对挑战如何改进诊断等5个方面与国内同道共同学习交流，欢迎留言。

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耶氏肺孢子菌的临床特征

01

生物学特性

耶氏肺孢子菌是一种条件致病性真菌，广泛存在环境中，目前仍不能在体外进行培养。当肺孢子菌的包囊被吸入人的肺部，包囊破裂，滋养体被释放，吸附于肺泡I型上皮细胞，感染部位滋养体与包囊的比例通常为10：1或更高，滋养体通过无性或有性繁殖形成新的包囊，引发相关肺部损伤。

02

感染史与独立高危因素

肺孢子菌首次被当作临床致病病原体，是由于二次世界大战期间，它导致了欧洲孤儿院的肺炎患者和淋巴母细胞白血病患者的严重肺炎。HIV流行期间，PCP尤其普遍。20世纪80年代，2/3的艾滋病患者患有PCP。随着High active antiretroviral therepy (简称HAART)疗法的出现和复方新诺明的发现，发达国家HIV感染患者PCP发病有所下降。但是，仍然有大量的HIV阳性患者感染PCP，包括还没有确诊或没有治疗或没有接受PCP预防性治疗的HIV阳性患者，以及没有采取HAART或对HAART治疗没有疗效的HIV阳性患者。

随着血液和实体器官移植患者增多，以及新的更有效的免疫治疗的使用，非HIV感染的PCP患者也在增加，如：血液恶性肿瘤、实体肿瘤、长期大剂量激素使用、干细胞移植、器官移植、结缔组织疾病和使用免疫抑制剂。

03

死亡率高

PCP的死亡率较高，医院HIV阳性PCP患者的存活率仅为7%-20%，HIV 阴性PCP患者的存活率为29%-60%。

04

临床表现无特异性

PCP常见临床表现：亚急性呼吸困难、干咳、低热。尤其注意的是，HIV阴性患者的PCP症状比HIV阳性患者的更严重。典型的影像特征包括双肺门周围间质性浸润，胸部CT可见毛玻璃样影像。

05

高危人群建议采取预防性治疗

所有HIV阳性患者的CD4＋细胞计数低于200个/mm³时，都应该采取预防性治疗。由于新的免疫治疗和器官移植的增多，获得性和遗传性免疫缺陷的HIV阴性患者，也应该接受预防性治疗。尽管复方新诺明仍然是一线治疗药物，但是其也有许多副作用，如:过敏、肝炎、骨髓抑制和间质性肾炎。

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PCP临床检测常见标本类型

耶氏肺孢子菌是一种近乎专性肺泡病原体，在早期诊断中主要通过肺活检来获取组织样本进行染色鉴定。随着诊断方法和技术的进步，活检已被更微创的取样技术所取代，如下所述关于样本类型的描述，详见图1。

图1 PCP潜在诊断的样本类型（首选呼吸道标本）

01

BALF样本

BALF是目前诊断PCP的金标准样本，然而取样存在一定的局限性，侵入性手术操作会增加患者的感染风险，尤其对于严重肺部疾病患者这种操作的结果可能是致命性的。

02

痰液样本

痰液（Sputum）样本为无创取样首选，根据一项包括322名个体研究的荟萃分析，发现在低患病率情况下，荧光染色的阴性预测值大于95%；然而在高度疑似PCP的病例中，当检测结果为阴性时，应进行BALF取样检查。当使用PCR方法检测时，痰液样本具有85%-100%的灵敏度，与BALF结果具有高度的一致性。

03

口腔冲洗液样本

口腔冲洗液样本可以快速无创获取，阳性检测结果反应呼吸道中存在肺孢子菌，然而在理论上口腔分泌物会对PCR产生抑制，最近多项研究已经评估了使用高灵敏度的PCR检测系统在口腔冲洗液洗样本中检测耶氏肺孢子菌的能力。与痰液样本和BALF样本相比，口腔冲洗液样本PCR检测的灵敏度为75-91%，特异性为68-100%。如果口腔冲洗液样本检测结果为阳性，可能有助于PCP的诊断，但是阴性检测结果就无法排除患者是否未感染肺孢子菌。

04

鼻咽抽吸物样本

对于幼儿患者来说，痰液样本和BALF样本较难获取，鼻咽抽吸物样本相对较易获取。在一项研究中，与BALF和痰样本相比，鼻咽抽吸物样本的PCR检测肺孢子菌具有86%灵敏度，95%特异性。

05

全血/血清样本

全血和血清样本的主要优点就是取样便宜和方便。血中肺孢子菌的检出，代表疾病的进展已经不限于肺部。研究表明血清肺孢子菌DNA检测可能是PCP诊断的一个有意义的标志物。

06

尿液样本

尚未搜到采用尿样本检测PCP的文献报道。尿抗原检测组织包浆菌病是有价值的，也有文献报道用尿侧流检测技术检测其它真菌感染，如隐球菌病、芽生菌病和曲霉菌病。尿检测PCP可能是一项无创分子诊断技术发展的前沿技术，但需要进一步的研究加以确认其可行性。

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传统PCP病原体检测

肺孢子菌体外极难培养，诊断依据患者的症状、影像学特征，确诊靠微生物染色。然而，值得注意的是染色检测不灵敏，结果依赖样本类型和质量，以及检验人员的技术和经验。常用的包囊染色技术可能低估了以滋养体为主的活动性感染的发病率。此外，当真菌含量较低，如HIV阴性或采取PCP预防性治疗的患者，染色镜检可能出现假阴性。

01

非免疫荧光染色

Giemsa、Diff-Quik和Wright 染色法可以染色包囊，但不能染色细胞壁；GMS（六胺银染色）、Gram-Weigert、Cresyl echt violet 、TBO（甲苯胺蓝染色）和CW（钙白染色）可以染色包囊细胞壁。Giemsa、Diff-quik、Wright-Giemsa、巴氏染色和Gram-Weigert可以染色滋养体。

钙白染色、GMS与TBO灵敏度的对比，参见表1：

表1 GMS、CW与TBO的灵敏度比较

02

免疫荧光染色

PCP单克隆抗体标记的免疫荧光染色较传统染色有较高的灵敏性（48-100%）和特异性（82-100%）。该方法简单、易于重复操作，较少依赖操作者的经验和技巧，此外还可以同时染色滋养体和包囊。

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新型PCP检测方法

01

PCR检测技术

20世纪80年代，PCR最早用于检测肺孢子菌线粒体大亚基核糖体RNA。无论患者HIV是否阳性，PCR检测肺孢子菌比染色方法灵敏度更高，灵敏度可能是染色检测的10⁴到10⁶倍，近年来发表的三项荟萃分析报告显示，大多数样本为BALF，其合并灵敏度分别为98%、99%和97%，合并特异性分别为91%、90%和94%。因为PCR的灵敏性高，很少出现假阴性结果，所以BALF样本PCR阴性结果，通常表示PCP不太可能，这时医生就要考虑其它的病因；反之，BALF样本PCR阳性结果，高度提示肺孢子菌的存在。

图2 原文中的PCP检测方法的比较 

02

LAMP检测技术

环介导等温扩增技术（LAMP）只需要一个恒温加热设备即可扩增目标基因，可作为PCR的一项替代技术，其灵敏度为87.5-95.4%，与其它真菌种类没有交叉反应，具有较好的特异性。某些情况下，仅用不可见光照射和加热模块，就可目测LAMP的检测结果，可作为一种特别快速和简单的分析方法。

此外，作者还列举了流式细胞技术、抗体检测技术、抗原检测技术在PCP诊断中的应用，有兴趣的读者可以查阅原文。

为方便阅读，本软文作者把原作者表1中的数据做了如下筛选整理（见表2），供阅读参考。

表2 主要数据摘录如下

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面对挑战如何改进诊断

图3 总结当前的挑战和改进PCP检测与诊断的潜在解决方案

01

定植

大约9%-69%的免疫抑制患者存在肺孢子菌的定植而没有被发现。定植可以进一步发展为活动性感染，早期鉴别高危人群或预防性用药可以有效降低发病率和死亡率。一项荟萃分析表明，31.8%定植患者是PCP或发展为PCP。

 目前的诊断金标准（PCP染色）是次优选项，PCR有助于活动性感染早期诊断。文献报道，PCR可以鉴别定植与感染，cutoff 值小于1000拷贝DNA，即为定植。但是，不同的PCR技术和基因靶点带来了不同的cutoff值。PCR与G试验的联合检测可能更有效地鉴别PCR弱阳性的患者。另外，针对滋养体的PCR标志物也可能是诊断感染的一个有效方法。

02

技术标准化

多个组织发布了诊断指南指出，PCR应该是PCP的标准诊断方法，许多PCR检测试剂盒获得CE注册，并在欧洲使用。但，目前为止尚无PCP分子诊断试剂获得NMPA（国家药监局）的批准，这就限制了PCR在中国医院的使用；困难之处在于，RNA和DNA的提取方案、样本浓度、靶基因、热循环方案、结果定量和确认。

03

面对资源贫困的环境

特定的取样和诊断方法对于资源贫困地区是不可行的。BALF的取样和支气管镜，其成本、有创和专业技术在贫困地区都是不现实的。而，诱导痰则是优先选项。对于儿童来讲，鼻咽部抽吸物和口腔冲洗液也是不错选择，但是在没有分子诊断方法的情况下，其灵敏度有限。对于无创样本，PCR被认为是性价比最好的一项技术，在贫困地区，LAMP是PCR的最好替代，它有与PCR相似的检出率，只需要一个恒温设备即可操作。

04

对宿主因素理解不足

研究表明，HIV阳性和阴性患者的PCP表现不同，因此需要不同的检测手段加以区别。其它宿主因素，如COPD影响BALF的回流，降低检出率。预防性和经验性用药也会对诊断造成影响。

05

肺孢子菌耐药基因

肺孢子菌全球传播，并不断进化。基因多态性可能导致在特定地理人群中PCR或LAMP检测灵敏性降低，此外，基因多态性也影响治疗效果。研究表明，治疗失败的PCP病例，发现单核苷酸多态／单倍体基因，如DHFR和DHPS，它是复方新诺明和氨苯砜治疗靶点。有些商业PCR技术平台已经在检测mtLSU 基因和DHPS、DHFR突变基因。

作者希望诊断标准要统一，希望临床医生重视PCP的诊断和鉴别诊断。EORTC指南指出：组织中、BALF和痰样本中，采用传统或免疫荧光染色镜检的方法发现病原体，即确诊。临床医生对PCP的重视程度，是早期诊断和早期治疗的关键，对患者的预后至关重要。

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