NATURE｜抗癌药耐药性难题新解: 125种细胞系和2025种药物组合筛选诠释

耐药性

耐药性是癌症治疗的一个巨大挑战，靶向抗癌药物的联合疗法有可能克服耐药^[1,2]、增强对现有药物的反应、降低单药剂量限制及毒性并扩大适应症范围。然而，有数十万种潜在的药物组合，很难说哪些是有效的。今天和大家分享2022年2月发表在Nature上的标题为Effective drug combinations in breast, colon and pancreatic cancer cells 的研究论文。在这篇论文中，研究人员广泛分析了 125 种细胞系对2025种药物组合的反应，从而产生了世界上同类资源中最大的资源库。这些信息有望帮助研究人员预测哪些联合疗法值得前临床研究。

技术方法

为了有效筛选，研究人员使用 2 × 7 浓度矩阵或“锚定”方法，以两种优化浓度和库化合物的不连续 1,000 倍（7 点）剂量反应曲线筛选每种锚定化合物。对每个细胞系进行单剂和组合活力测试，并得出参数，包括

（1）锚定活力效应；

（2）最高使用浓度下的文库和组合活力效应（分别为文库 Emax 和组合 Emax）；

（3）估计的文库药物浓度，使文库和组合的活力降低 50% (IC50)。将观察到的组合细胞反应与基于单一疗法活性的Bliss独立性预测反应进行比较，并根据药效（ΔIC50，即敏感性增加）或效力（ΔEmax，即细胞活力降低）的变化对药物组合进行分类。

研究结果

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基于癌细胞系的药物组合筛选

为了系统地识别药物组合活性，研究人员在125 种药物敏感性癌症(GDSC) 细胞系中，测试了2,025 种成对药物组合的作用，包括乳腺癌（n = 51）、结肠直肠癌（n = 45）和胰腺癌（n = 29）（图 1a），并为 108,259 个组合-细胞系对生成了 296,707 个药物组合活力测试值。同时，富集了针对关键靶点和通路的药物（n = 20），例如乳腺中的 ERBB2 抑制剂和针对结肠和胰腺中 MAPK 信号传导的药物。在所有三种组织中共测试了 121 种组合，通过降维（t-SNE）显示细胞系按组织适度混合，表明组合对组织反应有一定影响。通过ΔIC50对所有组织特异性和泛组织组合进行聚类，发现组合分为三大类：（1）广泛活跃，（2） 最低活性和（3）可变活性（图1b）。

△ 图1. 大型药物组合筛选

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药物相互作用的前景

总共108,259 个组合-细胞系对中有 5.2% 显示出协同作用，其中胰腺 (7.2%) 的比率最高，其次是结肠 (5.4%) 和乳腺 (4.4%)。在高锚浓度和低锚浓度下仅观察到 27.5% 的协同组合-细胞系，表明在特定浓度范围内检测到协同作用（图 2a）。54.9% 的协同测试影响疗效 (22.2%) 或效力 (32.7%)，而 45.1%影响两者，表明这两个指标产生互补反应（图2b）。

当化疗药物与靶向凋亡信号和细胞周期抑制剂的药物配对时，协同作用显著富集（超几何检验，调整后的 P ≤ 0.05），每个组织的化疗药物和细胞周期抑制剂之间超过 76% 的协同作用发生，与 navitoclax 协同的靶向药物大多是组织特异性的（图 2c）。值得注意的是，在所有 PAM50 亚型中，除了 HER2 细胞系17%，(1/6）外，至少三分之二的 navitoclax-AURKi 组合经常有协同作用，在基底样乳腺癌中63%（19 个细胞系中的 12 个，12/19），在 LumA 中73%（8/11 ），在LumB 中75 %（3/4）（图 2d）。

基于 IntAct12 数据库，将所有 57 种靶向化合物的药物靶标叠加到由 14,431 个蛋白质节点和 110,118 个边缘组成的蛋白质-蛋白质相互作用组上，过滤独特的人类蛋白质-蛋白质相互作用（置信度阈值：0.5）。计算了药物靶标节点之间的最短有限网络距离，平均而言，靶标在彼此相距一到两个节点之间的组合产生最大的协同作用（图 2e）。

研究人员根据每种药物的治疗靶点将组合按组织分组为独特的通路对，18%（136 个中的 25 个）通路对在至少一个组织中的协同作用显著富集（超几何检验，P ≤ 0.005，错误发现率（FDR） ≤ 5%，图 2f）。

△ 图2. 协同作用非常罕见，且高度依赖背景

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药物组合反应的分子标记

在分子背景下对细胞系进行分组，包括泛组织（3个组织）、单个组织和代表特定分子亚群的七个分子“篮”（TP53、KRAS、PIK3CA、乳腺PIK3CA、基底样乳腺癌、结肠癌KRAS和结肠癌微卫星稳定MSS，图1a）进行多项分析。TP53、KRAS和PIK3CA是最常见的基因突变细胞系，组织内分子“篮”代表未满足临床需求的癌症。

在 7,941,266 次方差分析 (ANOVA) 中，发现 8,078 个关联是显著的且具有较大的效应量（图1a）。在4,798 个显著的联合反应生物标志物中，18.4%、15.8% 和 65.7% 分别与效力（ΔIC50）、功效（ΔEmax）和联合活性相关（图 3a）。在 2,025 种组合中，28.7% 具有至少一种组合反应生物标志物。最后，确定了超过 2,050 种独特的分子“篮”分析组合生物标志物。

药物靶点的组合生物标记物很多表达olaparib（PARP1/2抑制剂）组合中的PARP1基因，并且CDK12、ERBB2和MED24基因的拷贝数增加，可作为预测乳腺癌对ERBB2靶向组合的敏感性指标。NRAS的低表达预测了乳腺癌对达布拉非尼（BRAF抑制剂）和曲美替尼（MEK1/2抑制剂）的反应，这代表了一种生物标记物，该标记物距离联合药物靶点一个节点（图3b）。PIK3CA 的突变预测了在泛组织 KRAS 突变环境中对林西替尼（靶向 IGF1R）+ MK-2206（AKT1 / 2 抑制剂）的反应，并且距离两种药物的靶标有两个节点（图 3c）。

在具有三个以上协同细胞系的组合-组织对中，研究人员发现 662 个中的 164 个（24.8%）具有至少一种相关的 ΔEmax 或 ΔIC50 生物标志物（图 3d）。例如，与 sapitinib（EGFR 和 ERBB2/3 抑制剂）和 JQ1（BRD2、BRD3、BRD4 和 BRDT 的抑制剂）联合使用的所有七种乳腺细胞系均显示 ERBB2 的增加（图 3e）。在泛组织环境中，KRAS 突变与对曲美替尼（MEK1/2 抑制剂）和 MK-2206（AKT1/2 抑制剂）的敏感性显著相关，并且74% 的协同细胞系是 KRAS 突变体（图 3f）。

△ 图3. 包含多组学特征的生物标志物管线可识别特定背景下的关联

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临床需求未满足的癌症群体的药物组合

研究人员利用许多细胞系和分子多样性来研究在三个临床需求未得到满足的人群中筛选组合的协同率、生物标志物和临床试验：基底样乳腺癌患者 (n = 22)、MSS 结肠癌患者 (n = 31）或 KRAS 突变结肠癌（n = 25）。

通过比较这些群体中的每一个与来自同一组织的其他细胞系的组合协同率（图 4a），发现所有组合中的 3% - 5% (n = 107) 来自这些群体的至少 25% 的细胞系中具有协同作用。在这 75 种独特的组合中，确定了 11 种组合在clinicaltrial.gov 上匹配试验，用于基底样乳腺癌（10 项试验）或 MSS 结肠癌（1 项试验）（图 4b）。顺铂与吉西他滨或MK-1775联合使用在基底样乳腺癌中具有高度协同作用（协同率分别为47%和59%），这两种组合均在三阴性乳腺癌的临床试验中（图4a）对顺铂+吉西他滨的协同作用进行了测试，并在验证筛选中表现良好（88%的协同作用重叠）。navitoclax（BCL2、BCL-XL 和 BCL-W 抑制剂）与吉西他滨、多西他赛和紫杉醇等化疗药物组合在基底样乳腺中均具有较高的协同率（63%、41% 和 38%；图 4a)。

三分之一或更多未满足需求的人群中至少有一个ΔEmax或ΔIC50排名靠前的组合生物标记物，其中一些在定义人群的分子“篮”中被识别（图4b）。

△ 图4. 未满足临床需求的人群以及伊立替康和 CHEK1 抑制剂联合治疗的验证

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伊立替康和 CHEK1i 在结肠癌中的协同作用

最佳协同组合之一是喜树碱（TOP1 抑制剂）与 AZD7762（CHEK1/2 抑制剂）。该组合在 MSS 结肠癌细胞系中协同率很高（分别为 62.1% 和 53.3%），其效力和功效显著高于 MSI 细胞系（student t 检验，P < 0.005；图4c）。接下来将喜树碱与六种具有不同选择性的 CHEK1/2 抑制剂组合。CHEK1 选择性抑制剂 SAR-020106 和 rabusertib 在 4 个细胞系中与喜树碱联合使用后，在效力（中位 ΔIC50：8.5 至 10.5 倍变化）和功效（中位 ΔEmax：0.22-0.24）方面产生了很大变化，而 CHEK2 选择性抑制剂 CCT241533 没有改变（图 4d）。

在菌落形成试验中，与单独使用任一药物或将SN-38与CCT241533（CHEK2）联合使用时相比，低浓度SN-38与rabusertib（CHEK1抑制剂）结合使用可导致菌落减少和细胞数死亡增加（图4e）。SN-38 + rabusertib组合的细胞死亡效应超过了许多结肠癌细胞系的加成反应（图4e），尤其是在单独对SN-38由弱至中度反应的细胞系中。组合效应范围从非加成到稳健增强，所有MSS和大多数KRAS–TP53双突变细胞系至少显示出加成反应（图4e）。该组合诱导凋亡标记物caspase 3/7和PARP裂解的激活（图4f）。

研究人员将三种结肠癌细胞系（LS-1034、SW837和SNU-81）植入NOD/SCID小鼠，并用伊立替康、rabusertib或其组合这两种药中的一种治疗24-35天。实验表明，在LS-1034和SW837中，TOP1i和CHEK1抑制剂组合显示细胞死亡率高于SNU-81（图4e）。随着时间的增加，联合治疗对肿瘤体积和肿瘤生长的抑制作用增强，比单独使用伊立替康更明显（韦尔奇t检验，P < 0.05，图4g）。在 SNU-81中，与单独使用伊立替康治疗的小鼠相比，接受联合治疗的小鼠在停药后肿瘤生长的恢复延迟，表明健康劣势（图 4h）。与伊立替康治疗的 LS-1034 肿瘤相比，联合治疗开始后 72 小时导致更多的 DNA 双链断裂（磷酸化 H2AX 阳性细胞）、更少的增殖和更多的肿瘤细胞凋亡（图 4i）。

总结

本研究评估了 2,025 种临床相关的两种药物组合的效力和疗效，生成了一个包含 125 种分子特征的乳腺、结肠直肠和胰腺癌细胞系的数据集，确定了不同分子中临床相关的有效药物组合亚群。该数据库是指导合理开发药物治疗组合，催化新发现的沃土，也是有效合理组合疗法的基础。

参考文献

1. Al-Lazikani, B., Banerji, U. & Workman, P. Combinatorial drug therapy for cancer in the post-genomic era. Nat. Biotechnol. 30, 679–692 (2012).

2. Lopez, J. S. & Banerji, U. Combine and conquer: challenges for targeted therapy combinations in early phase trials. Nat. Rev. Clin. Oncol. 14, 57–66 (2017).

撰文：陈善军

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