技术解读丨深入解析1000多个阿尔茨海默症脑组织的蛋白质组新变化
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Alzheimer’s disease
阿尔茨海默症(AD)至今仍然没有有效的改善疗法。以往的基因组学或转录组学研究，虽然发现一些与AD遗传风险相关的因素，但其疾病过程的蛋白质组和代谢组的改变仍然不明。近来，埃默里大学医学院的研究人员利用蛋白质组学技术分析了1000多个脑组织的蛋白质组，揭示了新的AD相关的蛋白共表达模块。该团队的研究结果发表在Nature Neuroscience ,题为Large-scale deep multi-layer analysis of Alzheimer’s disease brain reveals strong proteomic disease-related changes not observed at the RNA level（IF:24.448)
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研究发现，这些模块在队列和大脑区域中高度保存。近一半的蛋白质共表达模块在来自相同队列和大脑区域的 RNA 网络中没有被观察到，包括在 AD 中显著改变的模块，这突出显示了 AD 的蛋白质病理特性。蛋白质组特有的疾病相关模块是有希望的 AD 治疗靶点和生物标志物的来源。
研究路线
研究人员使用TMT标记串联质谱(TMT-MS)方法和AMP-AD联盟的脑组织样本生成一个显著扩展的深度TMT AD蛋白网络，以扩展之前的无标记定量质谱(LFQ-MS)网络，并揭示新的AD相关蛋白共表达模块。运用独立算法MONET M1 生成共表达网络，来测试 WGCNA 算法生成的基于 TMT 网络的稳健性。同时，利用脑组织队列来描述使用其他组学的模式，包括基因组学和转录组学，进行多组学分析AD蛋白质网络以更好地理解这些不同数据类型之间的关联。
研究结果
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基于TMT 的AD蛋白质共表达网络
本研究通过基于 TMT-MS 的定量蛋白质组学分析了 516 个背外侧前额叶皮层 (DLPFC) 组织，包括对照 (110)、无症状 AD (AsymAD, 206) 和 AD (200)（图 1a）。AsymAD 病例是那些具有与 AD 病例相似的 Aβ斑块和 tau 缠结的神经病理学表征，但在接近死亡时没有明显认知障碍，这被认为是 AD 的早期临床前阶段。经过数据处理和去除异常值后，研究人员使用加权基因共表达网络分析 (WGCNA) 算法，用 8,619 种蛋白质构建了一个蛋白质共表达网络（图1b）。该网络由 44 个WGCNA模块或蛋白质群落组成，并且所有 44 个 模块都高度保留在 MONET M1 网络中，证明了基于 TMT 网络对聚类算法的稳健性。
△ 图 1a .TMT AD 蛋白共表达网络
每个 TMT 网络模块所代表的生物学是由构成蛋白的基因本体论（GO）分析确定的（图 1b）。为了评估一个模块是否与AD的特征相关，他们将每个模块特征蛋白或模块蛋白表达的第一主成分（PC）与ROSMAP和Banner队列中存在的神经病理学或认知特征相关联（图1b）。通过确定每个模块是否富集细胞类型特异性蛋白质标记物来评估每个模块的细胞类型性质（图 1b）。十二个模块或模块系列与 AD 特征的相关性比其他模块或模块系列更强，这些包括突触后密度、糖基化/内质网 (ER)、少突胶质细胞/髓鞘形成、RNA 剪接、基质体、细胞-ECM 相互作用、突触/神经元、泛素化、丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 信号和代谢、线粒体、糖代谢和蛋白质转运模块（图1b）。
其中四个模块与AD 神经病理学或认知相关性最强——M5 突触后密度（整体病理学 r=–0.32, P=2.7 × 10−9; 整体认知功能 r=0.35，P=7.4 × 10-11），M7 MAPK 信号和代谢（整体病理学 r=0.37，P=4.9 × 10-12；整体认知功能 r=–0.42，P=1.2 × 10-15），M11 细胞-ECM 相互作用（整体病理学 r=0.34，P=4.1 × 10-10；整体认知功能 r=–0.33，P=1.1 × 10-9）和 M42 基质体（整体病理学 r=0.75，P =1.1 × 10−60；整体认知功能 r=–0.4, P=2.3 ×10−14)。TMT 提供的额外分析深度还能够识别与 LFQ 网络几乎没有重叠的大量新模块，其中包括 M17 转录、M21 主要组织相容性复合体/免疫、M6 核糖体、M19 轴突形成和 M9 高尔基体模块。
△ 图 1b .TMT AD 蛋白共表达网络
为了评估给定的 TMT 网络模块在 AD 的早期阶段是否发生了改变，他们比较了对照组、AsymAD 和 AD 病例中的模块特征蛋白（图 1c）。与对照组相比，AsymAD 中 12 个与 AD 相关性最高的模块中有 4 个显著增加或减少，而其他 8 个仅在 AD 中发生很大变化。AsymAD 中增加的模块包括 M42 基质体和 M11 细胞-ECM 相互作用，而 AsymAD 中减少的模块包括 M5 突触后密度和 M8 蛋白转运。
与tau 微管结合域 (MTBR) 肽水平升高相关性最强的模块是 M42 基质体和 M11 细胞-ECM ，而与 MTBR 负向相关性最强的模块是 M5 突触后密度和 M1 和 M4 突触/神经元。与 MTBR 相关的模块在 AsymAD 中也倾向于改变。
总之，研究人员构建了一个强大的能够高效检测 AD 相关模块的蛋白质共表达网络，包括之前在LFQ 网络中不存在的大量新模块。其中一些新模块在 AD 的早期阶段也发生了改变，这可能反映了在 AD 神经病理学存在但在认知下降之前发展的病理生理过程，并与 tau 失调相关。
△ 图 1c .TMT AD 蛋白共表达网络
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模块跨队列和大脑区域保存
为了确定网络模块是否也存在于其他大脑区域并且对中心和分析管线具有稳健性，研究人员分析了来自 ROSMAP 中 113 名参与者的额叶皮层 BA6（n=113）和颞叶皮层 BA37（n=113）的 226 对组织，来自Mount Sinai脑库的 151 个海马旁回 (PHG) BA36 组织和来自埃默里脑库的 DLPFC BA9 和前扣带回 BA24 的 40 个组织，其中还包括帕金森病 (PD) 病例（图 2a）。研究人员为每个队列生成了蛋白质共表达网络， 他们发现几乎所有的 TMT AD 网络模块都保存在队列和大脑区域（图 2b）。
通过测量每个单独网络中的 TMT AD 网络“合成”特征蛋白或每个共识模块中前 20% 的蛋白质，评估了 TMT AD 网络模块在每个队列和病例的大脑区域状态的异同（图 2c)。因为 ROSMAP BA6 和 BA37 组织是在受试者体内取样的，所以能够直接在同一个体的这两个区域之间比较模块特征蛋白合成。有趣的是，当在同一个体中评估时，颞叶皮层的 M7 MAPK/代谢和 M42 基质体模块比额叶皮层增加得更显著，这可能是由于在 AD 的早期就很严重的影响该大脑区域。总之，几乎所有的TMT AD网络模块都在不同的队列、中心、MS方法和大脑区域得到了保存，这表明观察到的蛋白质共表达关系具有稳健性，并且不是DLPFC独有的。
△ 图 2. 跨不同队列、中心、方法和大脑区域的 TMT AD 网络的保存
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在转录组网络中未观察到的模块
为了比较 RNA 和蛋白质在 AD 共表达网络之间的异同，研究人员在 532 个 ROSMAP DLPFC 组织中检测的 15,582 个转录本上生成了一个 AD RNA 网络，其中 168 个与生成 TMT AD 蛋白网络的组织重叠（图 3a）。与测量的蛋白质相比，产生的 RNA 网络比蛋白质网络包含更多模块（n=88 对 44）。使用网络存储的统计数据来确定哪些蛋白质网络模块保存在RNA网络中。结果发现，略多于一半的蛋白质模块被保存在RNA网络中（Zsummary>1.96或P≤0.05）。
RNA网络中保存的模块包括AD相关模块M1突触/神经元、M2线粒体、M3寡聚/髓鞘化、M5和M22突触后密度、M8蛋白质运输、M11细胞与ECM相互作用、M20 RNA剪接和M25糖代谢。然而，也有18个蛋白质网络模块没有保存在RNA网络中，包括AD相关模块M7 MAPK/代谢、M24泛素化、M29糖基化/ER和M42基质体（图3b）。
在这些模块中，M7 MAPK/代谢模块（TMT-AD网络中与认知功能高度相关的模块）保存最差，Z综合评分接近0，表明其对蛋白质组的高度独特性。该网络大约一半 (55%) 的蛋白质模块被保存在 RNA 中，这表明即使在从同一个体的同一大脑区域取样的组织中，蛋白质和 RNA 共表达之间也存在显著差异。M42基质体模块是TMT AD网络中蛋白差异表达最显著的。总之，蛋白质网络模块与认知功能的相关性比 RNA 网络模块更强，但在大多数情况下，它们与病理学的相关性与 RNA 模块相似（在正向和负向平均约为 0.15）。一个显著的例外是M42 基质体模块与任何AD特征的相关性最强，与整体病理学的相关性为0.75，并且不存在于RNA网络中。
△图 3.TMT AD 蛋白网络包含转录组中不存在的与 AD 相关的模块
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模块中与斑块和缠结共同定位的蛋白质的富集
研究人员发现 M1 和 M4 突触/神经元、M2 线粒体和 M14 蛋白质折叠模块在斑块和神经原纤维缠结 (NFT) 中的蛋白质高度富集。M7 MAPK/和 M25代谢模块也富含斑块和缠结，但更富含 Aβ 斑块相关蛋白。NFT 富含来自 M28 和 M44 核糖体/翻译的蛋白质，M29 糖基化/ER 和 M13 RNA 剪接模块。令人惊讶的是，尽管淀粉样前体蛋白 (APP)（主要由 Aβ 驱动的蛋白质组学测量）和载脂蛋白 E (ApoE) 是该模块的成员，但 M42 基质体模块并未显著富集 LCM 鉴定的核心斑块蛋白。当分析扩展到至少一个LCM实验中确定的一组较不严格的斑块相关蛋白质，而不是多个实验中确定的蛋白质时，发现M42在斑块相关蛋白质中显著富集。这表明TMT蛋白质组学和共表达分析可能捕获了大量相关蛋白斑块，例如 SPARC 相关的模块钙结合蛋白1 (SMOC1)、中期因子 (MDK) 和 netrin-1 (NTN1)。通过模块特征蛋白相关值（kME）与前 50 的 M7 MAPK/代谢和 M42 基质体模块蛋白 与NFT 和核心 Aβ 斑块蛋白重叠，如图 3d 所示。总之，几个基于TMT的 AD 蛋白质网络模块富集了在 NFT 和 Aβ 斑块中发现的蛋白质，包括 M7 MAPK/代谢模块。
△ 图 4.M42 基质体模块富集 AD 遗传风险因子，并因 APOEε4 而增加
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基质体模块蛋白水平受到APOEε4的影响
研究人员通过全基因组关联研究 (GWAS) 评估了哪些TMT AD网络模块在与AD相关的基因位点中富集。基于基因的关联测试发现M42基质体、M30蛋白酶体和M29糖基化/内质网模块显著富集了AD风险基因，而M7 MAPK/代谢模块显示出富集趋势。M42的显著富集是由模块内对AD风险影响很大的载脂蛋白E驱动的。
为了探索相关基因组变异如何影响模块水平，他们使用 ROSMAP 和 Banner 队列提供的全基因组基因分型进行了模块数量性状基因座 (mod-QTL) 分析。在全基因组显著性水平上，并调整诊断和性别等变量后，发现 rs429358 （APOEε4 等位基因）是 M42 基质体模块的近端 mod-QTL（在 1 Mb 内，即顺式）。当通过 rs429358 单核苷酸多态性（SNP）的剂量绘制 M42 特征蛋白时， mod-QTL 更加明显（图 4b）。此外，M42 是唯一观察到因 APOE 基因型而变异的模块（图 4c）。值得注意的是，在针对诊断进行调整的线性回归模型中进行测试时，rs429358 不影响 ApoE 蛋白水平（P=0.44）。当通过基因型和病例状态分析 ApoE 蛋白水平时证实了这一点（图 4d），表明由 rs429358 引起的 M42 水平的变化与 ApoE 水平无关。
总之，三个TMT AD网络模块显著富集了AD遗传危险因素，其中模块m42基质体的水平受APOE基因型或载脂蛋白蛋白水平的影响，特别是在疾病的无症状阶段。
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MAPK/代谢模块与认知轨迹相关
研究人员发现了 10 个与认知衰退显著相关的模块和 11 个与认知保存显著相关的模块，但没有对神经病理学进行调整。与认知衰退最密切相关的模块包括 M7 MAPK/代谢、M15 模糊和 M42 基质体，而与认知保存密切相关的模块包括 M33 模糊、M5 突触后密度和 M2 线粒体。经神经病理学调整后，M42 基质体、M11 细胞-ECM 相互作用、M20 RNA 剪接和 M25 糖代谢模块不再与认知能力下降显著相关，M44 核糖体/翻译、M32 模糊和 M9 高尔基体模块不再与认知保存有关。M7 MAPK/代谢及其相关模块 M15（模棱两可）与调整后的认知下降率以及其他五个模块（包括 M24 泛素化模块）显著相关（图 5a）。与认知衰退率显著相关的七个模块中有五个是蛋白质网络所独有的。
在神经病理学调整后仍然与认知保存显著相关的模块包括 M2 线粒体和相关模块 M33（模糊）、M5 突触后密度和蛋白质网络特有的 M29 糖基化/ER 模块（图 5b)。为了进一步研究基于TMT AD网络模块与认知轨迹的关联，评估了那些模块在神经病理学调整后富集与认知韧性正相关或负相关的蛋白质（图5c）。
研究总结
研究人员通过TMT-MS分析了跨多个中心、队列和脑区域的1000多个脑组织，开发了一个强大的基于TMT AD蛋白网络并显著扩展了之前共识的LFQ AD网络。其次，整合多组学研究发现了在基于RNA的网络中不存在并与AD密切相关的新的蛋白质网络模块。这些发现突出扩展了蛋白质组学分析方法的深度以及实用性，表明整合多组学数据有助于进一步了解疾病机理和潜在的靶点以促进临床治疗方法的改善。
撰文：陈善军
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