文献解读 | 结直肠癌的蛋白质组学分析确定PLOD2为潜在的新治疗靶点
结直肠癌（CRC）是发达国家癌症死亡的第二大原因[1]，也是严重危害我国居民健康的三大恶性肿瘤之一，如何早期发现，精准治疗，降低结直肠癌的发病率和病死率是目前学者们关注的热点。最近，有研究团队采用了优化的压力循环技术 (PCT) 与数据独立采集质谱 (DIA-MS) 相结合，对活检水平的福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组织样本进行可靠且可重复的蛋白质组学分析[2]，表征了与 CRC 发生和进展相关的蛋白质组动力学，确定了用于阻断潜在致癌过程的新治疗靶点。该研究成果发表在Clinical and Translational Medicine，题目为 Proteomics profiling of colorectal carcer progression identifies POLD2 as a potential therapeutic target 。
在这项研究中，作者分析了 CRC 从正常结肠组织演变为增生性息肉、腺瘤、不明确型腺癌 (AC) 或粘液性腺癌 (MC) 的蛋白质组学组织图景。
实验设计
样本：FFPE样本，正常结肠 (n = 16)、增生性息肉 (n = 17)、腺瘤 (n = 22)、不明确型腺癌 (AC) (n = 15)、粘液腺癌 (MC) (n = 15)
质谱技术：DIA和PRM方法
实验路线图：
实验结果
1
鉴定到差异表达蛋白质
图1A. 本研究的实验设计示意图。
无监督聚类分析选择了与 CRC 发展相关的六种具有生物学意义的蛋白质表达模式。模式 1、2 和 3 是由上调的蛋白质组成的，而模式 4、5 和 6 是由下调的蛋白质组成的（图 1C）。用于富集六个簇中的生物过程的基因本体分析确定了模式 3 中的细胞外基质（ECM）富集。然后，检查了“基质体”中的所有 ECM 相关蛋白，包括核心 ECM 蛋白组合（糖蛋白、胶原蛋白和蛋白聚糖）和 ECM 相关蛋白（ECM 附属蛋白、ECM 调节因子和分泌因子）。在六种蛋白质表达模式中，其上调模式中 的ECM 调节因子富集。每种模式中的蛋白质通过带有 GeneMania 的 Cytoscape 形成蛋白质-蛋白质相互作用网络。
图1C. 无监督聚类蛋白质组动力学揭示了 CRC 进展中的六种蛋白质模式。
2
PLOD2显著上调
研究人员接下去将关注范围缩小到在肿瘤进展阶段持续上调的蛋白质。分析结果显示，在质膜、细胞核、细胞质、细胞外空间和其他位置中，细胞质和细胞外空间是失调蛋白表达最高的位置。CRC进展与多种酶的表达显著增加有关。值得注意的是，Procollagen-Lysine, 2-Oxoglutarate 5-Dioxygenase 2 (PLOD2) 是上调最多的蛋白质（图 1D ）。癌前和癌变样本与良性样本之间进一步的配对比较研究发现，PLOD2 始终显著上调 。
图1D. 与正常结肠组相比，CRC 中失调酶的蛋白质定位统计显示PLOD2 差异表达最为显著。
图1(E).PRM-MS 对 PLOD2 的表达。数据为平均值±SEM。(F) 4 名新患者的 CRC 肿瘤和配对癌旁组织中的 PLOD2蛋白印迹（WB）检测。（G）代表性 IHC 染色 CRC 和来自 TMA 的正常结肠组织中的 PLOD2 表达和相应PLOD2 阳性结肠或肿瘤细胞的百分比。(H) 基于 TMA PLOD2 表达评分的 CRC 患者总生存期 (OS) 的 Kaplan-Meier 曲线（低，n = 27；中，n = 37 和高，n = 54，P = 0.0097。
3
6个CRC细胞系中PLOD2的表达
研究人员之后检测了 6 个 CRC 细胞系中的 PLOD2 表达，并选择了 PLOD2 表达最高的两个细胞系HCT116 和 HT-29，使用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术获得了 PLOD2 敲除 (KO) 同源系。用不同浓度的米诺地尔（一种 PLOD2 的赖氨酰羟化酶抑制剂）处理每对同类细胞系。米诺地尔以时间和剂量依赖性方式抑制两种野生型细胞系中 PLOD2 的表达，实验结果发现当 PLOD2 被米诺地尔抑制或敲除时，显著抑制细胞增殖和克隆形成（图 1I）。并且，米诺地尔处理和 PLOD2-KO 均抑制了 CRC 细胞的迁移和侵袭（图 1J）。
图1I. PLOD2 在 CRC 细胞系 (SW620, SW480, LoVo, HCT116, HT-29, RKO) 中的WB分析。PLOD2 在 HT-29、HCT116、它们的基因敲除细胞系和米诺地尔的不同浓度（0.5 mmol/L、1 mmol/L）或持续时间（24h、48h、96h）的处理组中WB分析。HT-29、HCT116、它们的 KO 细胞系和 1 mmol/L 米诺地尔处理组的集落形成和细胞增殖测定。
图1J. HT-29和HCT116的 KO 细胞系和 1 mmol/L 米诺地尔处理组的细胞迁移和侵袭测定。（左面板，transwell 室的代表性图像，50 × 和 200 ×；右面板，放大 200 × 时五个随机显微视野的平）计数)。
4
体内肿瘤模型验证
为了进一步验证上述结果，研究人员通过将HCT116 和 HT-29 细胞系皮下注射到裸鼠体内，构建了体内肿瘤模型。利用该模型在体内测试了安慰剂与米诺地尔对野生型 HCT116 和 HT-29 细胞产生的肿瘤的影响，并将 PLOD2-KO 的HCT116 和 HT-29 细胞产生的肿瘤与 PLOD2 高表达肿瘤的生长进行了比较。
数据显示，米诺地尔和 CRISPR-Cas9 介导的 PLOD2 抑制均导致肿瘤体积显著减小（图 1K）。第二种体内模型是来自四名 CRC 患者的异种移植 (PDX) 肿瘤。具有高水平PLOD2患者的肿瘤（PLOD2 阳性肿瘤细胞 > 80%）对米诺地尔抑制敏感，而 PLOD2 阴性肿瘤耐药（图 1L），突出显示了针对 PLOD2 靶向治疗的潜在临床应用价值。
图1K. 皮下小鼠模型和相应的皮下肿瘤剖析。对于 HT-29 和 HCT116，每隔一天腹膜内注射三组（-NC + PBS、-NC + 米诺地尔和 -KO + PBS），共注射 10 次（每组 n = 5∼6 只小鼠）。
图1L. 在指定天数用米诺地尔处理的 PDX 模型的生长曲线 (每组 n = 5 只小鼠)。PDX 肿瘤中 PLOD2 的免疫组织化学染色标记在顶部。
为了深入了解PLOD2 抑制如何压制 CRC 肿瘤进展的机制，研究人员分别使用 RNA 测序和 DIA-MS 比较了 HCT116-KO 和 HCT116-正常对照（NC）细胞系的转录组和蛋白质组。结果发现 1236 个上调和 955 个下调的转录本，以及 227 个上调和 127 个下调的蛋白质。数据表明，PLOD2 有助于肿瘤生长、抗细胞坏死，并且与CRC的发展密切相关。PLOD2 还参与蛋白质合成、代谢和 mRNA 翻译。
总之，本研究系统地追踪了随着恶性程度的增加，CRC组织中很多蛋白质的变化，表明POLD2与CRC的发展进程密切相关，其高表达将意味着CRC 患者较差的总生存期。通过蛋白质组学分析和多组学及体内实验等验证，PLOD2被确定为用于阻断致癌过程的潜在新治疗靶点。
参考文献
[1] Siegel RL, Miller KD, Fuchs HE, Jemal A. Cancer Statistics, 2021. CA Cancer J Clin. 2021; 71(1): 7- 33.
[2] Zhu, Yi, et al. "High‐throughput proteomic analysis of FFPE tissue samples facilitates tumor stratification." Molecular oncology 13.11 (2019): 2305-2328.
撰文：陈善军
审阅：钱丽琴、江燕
西湖欧米的DIA/4D-DIA/PulseDIA业务：
相对于DDA技术而言，DIA能够在单位时间内鉴定得到更多的多肽和蛋白质。
DIA带来高准确性、高重现性和高稳定性。
DIA仅需要极低的样本量就可以实现高灵敏度检测。比如DIA和PulseDIA, 只需要500ng的多肽就可以；而4D-DIA(diaPASEF)则更低，仅需要200ng的多肽。
PulseDIA技术，是西湖欧米的特色，更是西湖欧米独有专利。PulseDIA能够在传统DIA技术的基础上，将一个窗口根据质荷比分割成更小范围的多个窗口，并且将这些窗口以脉冲的形式均匀分配至不同的质谱方法进行采集。该方法能够带来相较于传统DIA更高的鉴定深度。
感兴趣的客户欢迎咨询
service@westlakeomics.com
关于西湖欧米
专注于生物技术攻关与辅助临床诊断与治疗的创新型生物科技公司。针对与生命健康有关的核心问题，西湖欧米致力于以技术创新为驱动力、以多模态大数据为基础，使用 AI 赋能微量临床组织的高通量蛋白质组分析等组学技术辅助精准医学和药物研发。
西湖欧米公众号
西湖欧米官网