初学必懂！分分钟搞定PCR引物技术，高效避“雷”！

PCR简单概述+基本原理

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ，PCR)：体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA 片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发甚至一个细胞中扩增出足量的 DNA 供分析研究和检测鉴定。  

基本原理：PCR 技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板 DNA经加热变性成单链后，温度降至 55℃左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR引物设计黄金法则

1.引物最好在模板cDNA 的保守区内设计。

DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在 15~30 碱基之间。

引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于 74℃，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

GC 含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm 值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm 值 5~10℃。若按公式 Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的 Tm 值，则有效引物的Tm 为 55~80℃，其 Tm 值最好接近 72℃以使复性条件最佳。

4.引物 3′端要避开密码子的第 3 位。

如扩增编码区域，引物 3′端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5.引物 3′端不能选择A，最好选择 T。

引物 3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为 A 时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T 时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于A、T 之间，所以 3′端最好选择 T。

6. 引物 5′ 端和中间△G 值应该相对较高，而 3′ 端△G 值较低。

△G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G 值越大，则双链越稳定。应当选用 5′ 端和中间△G 值相对较高，而 3′ 端△G 值较低（绝对值不超过 9）的引物。引物 3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G 值可以用 Oligo 6 软件进行分析）

7.引物的 5′端可以修饰，而 3′端不可修饰。

引物的 5′ 端决定着 PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

引物的延伸是从 3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。

8. 扩增产物的单链不能形成二级结构。

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件 （比如RNAstructure）可以预测估计 mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°） 小 于 58.6l kJmol 时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用 7-deaza-2′-脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功 是有帮助的。

9. 引物应具有特异性。

引物设计完成以后，应对其进行 BLAST 检测。做Real Time 时，用于 SYBR Green I 法时的一对引物与一般PCR 的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。

引物设计的要求：

1) 避免重复碱基，尤其是G.

2) Tm=58-60 度。

3) GC=30-80%.

4) 3'端最后 5 个碱基内不能有多于 2 个的 G 或C.

5) 正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

6) PCR 扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在 80-250bp 之间都可；80～150 bp 最为合适（可以延长至 300 bp）。

7) 引物的退火温度要高，一般要在 60 度以上；

如果实在满足不了这么多要求，那么就：

1引物与模板配对好；

2两个引物退火温度差不多；

3每个引物的GC 含量不要太高或太低；

4引物最好没有回文序列；

就这 4 点就很好了。如果还是满足不了！只要前2 点就够了。

技术总结：PCR常见问题汇总

PCR常见问题分析

1、PCR 产物的电泳检测时间

一般为 48 h 以内，有些最好于当日电泳检测，大于 48 h 后带型不规则甚致消失。

2、假阴性，不出现扩增条带

PCR 反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有 Taq 酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

无扩增产物

引物二聚体

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul、30ul、50ul。或 100ul，应用多 大体积进行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

物理原因：变性对PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，

可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR 扩增是不会成功的。

3、假阳性

出现的PCR 扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出 PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。

4、出现非特异性扩增带

非特异性扩增带

PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

5、出现片状拖带或涂抹带

PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP 浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少 dNTP的浓度。适当降低 Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。

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