这个课题有点厉害！2023年第一期Science就发表了两篇研究论文！

前言：

2023年1月5日，新年第一期Science出炉。日本RIKEN生物系统动力学研究中心Takanobu Katoh研究团队及美国麻省总医院Shiaulou Yuan研究团队在两项独立的研究中分别证明，LRO中的不动纤毛可充当力学传感器，其能将流动液体的生物机械应力转换为指导左右不对称的钙信号。下面我们重点介绍Shiaulou Yuan研究团队的论文。

▲第一作者：Lydia Djenoune, Mohammed Mahamdeh

通讯作者：Shiaulou Yuan

通讯单位： 美国麻省总医院

DOI：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.abq7317

01
研究背景

在人、啮齿动物、两栖动物和鱼类胚胎中，左右(LR)不对称性是由纤毛在左右组织器(LRO)决定的，纤毛产生细胞外液体的定向流动并将其转化为不对称的结节信号和器官偏侧性。然而，纤毛感知LRO流的机制尚不清楚，当前存在两个主要的假说：纤毛是形态物质的化学传感器或流体施加的力的机械传感器。以前的工作将不对称钙信号与LRO流动和LR的发展联系起来。然而，由于在体内向纤毛传递机械力或化学信号的技术不充分，所以不可能确定纤毛机械感觉或化学感觉是否介导了这些不对称的钙信号。

02
研究问题

本研究证明了固定的LRO纤毛是剪切力的机械传感器，使用的是一种结合了光学镊子、光片显微镜和深度学习的管道，以便在斑马鱼中进行活体分析。机械操纵静止的LRO纤毛激活了需要阳离子通道Polycystin-2的纤毛内钙瞬变。此外，施加在LRO纤毛上的机械力足以挽救和逆转缺乏运动纤毛的斑马鱼的心脏部位。因此，LRO纤毛是机械敏感的细胞杠杆，它将生物机械力转化为钙信号以传感左右不对称信号。

▲图1| CiliaSPOT是一个精确和可调的纤毛机械传感研究平台

要点：

1、为了便于在斑马鱼LR发育过程中同时对纤毛内钙信号和纤毛偏转的研究进行实时成像，本研究构建了一个定制的带有光学镊子的纤毛选择性平面照明显微镜(“CiliaSPOT”，图1，A和B)。选择性平面照明显微镜(光片显微镜)由于其快速的光学切片能力和减少的光漂白而提供对体内动态过程的快速和温和的成像（例如钙信号）。

2、本研究利用表达纤毛靶向比率荧光钙指示剂系统对体细胞期斑马鱼胚胎LRO中的静止纤毛上验证了CiliaSPOT的性能，本文作者以前使用该系统来发现LRO中的纤毛内钙瞬变。CiliaSPOT仅用100 mW的激光功率就能有效地捕获LRO中的荧光纤毛，并能够以振荡的方式偏转静止的纤毛，模拟它们在体内的正常运动(图1C至F)。CiliaSPOT对LRO纤毛的作用力估计为0.6 pN，这与对LRO纤毛(0.1 pN)的体内流动力估计和先前的体外研究一致。

3、为了分析荧光成像数据，本研究还创建了纤毛神经网络(“CiliaNet”)，用于自动跟踪移动的纤毛和提取荧光信号变化(图1G和H)。CilianNet能够快速分析本研究的高速(7赫兹)双通道纤毛钙动态记录，即使在数千帧的大型记录中也是如此，从而简化了纤毛钙对光学弯曲的反应的量化。本研究通过比较手工分析和机器分析的数据集，验证了CiliaNet在CiliaSPOT记录上的准确性：在保真度相近的情况下，CiliaNet比人工分析快8倍。CiliaSPOT和CiliaNet共同为实验测试和分析纤毛机械感觉和钙信号提供了一个强大的平台。

▲图2|机械振荡刺激LRO纤毛激活纤毛内钙瞬变

要点：

1、利用CiliaSPOT观察到c21orf59敲击胚胎的静止LRO纤毛时有出现纤毛内钙瞬变，并以受控和振荡的方式弯曲(图2A到D，图3A到D)。

2、另外，长时间的机械振荡，重现了具有完整血流的WT胚胎LRO中的生理纤毛行为，这触发了重复的纤毛内钙瞬变，类似于先前描述的ICOs (图2D)。

3、本研究发现，所有纤毛，无论它们在LRO中的位置，都可以通过纤毛内钙瞬变对CiliaSPOT偏转做出反应(图2F)，这表明内源性左侧LRO是对定向LRO流动施加的力做出反应的。响应LRO纤毛的CiliaSPOT弯曲的钙瞬变在空间上不是自主的，因为钙瞬变通常扩散到细胞体、邻近的LRO细胞和LRO周围的中内胚层组织(图2G到K)。

▲图3|睫状肌机械感觉需要多囊蛋白-2

要点：

1、本研究发现，WT斑马鱼静止的LRO纤毛的振荡偏转激活了纤毛内的钙瞬变(图3F到J)，这与操纵的纤毛在LRO内的位置无关(图3L)。这不仅证实了本研究对c21orf59基因敲除胚胎的研究结果，也表明静止的LRO纤毛能够对机械刺激做出反应，即使受到内在的逆时针方向流动。总之，本研究的结果表明纤毛是一个真正的机械传感器，在LRO中介导钙信号。

2、值得注意的是，本研究发现在pkd2基因敲除的静止LRO纤毛中，CiliaSPOT诱导的纤毛内钙瞬变的发生率显著降低(图3)。此外，在pkd2突变胚胎中，LRO纤毛弯曲后胞浆钙活性没有升高(图3k)。这种光钳pkd2突变体胚胎内钙瞬变的丢失证实了CiliaSPOT诱导的WT和c21orf59基因敲除胚胎的纤毛钙瞬变不是由光损伤或微损伤引起的。这些结果支持pkd2在LRO纤毛上作为机械敏感的钙通道的作用。 

▲图4|睫状机械感觉是 LR 不对称的决定性因素

要点：

在小鼠、斑马鱼和非洲爪哇的LR发育过程中，定向LRO流体流动对于Nodal信号组件的不对称基因表达是必不可少的。本研究和其他人以前将定向流体流和ICO与dand5的左侧降解联系在一起，dand5是第一个不对称表达的基因，也是Nodal信号的上游抑制物。为了测试纤毛机械感应本身是否足以实现Dand5的不对称表达，本研究使用光钳弯曲了c21orf59基因敲除斑马鱼的纤毛，这些斑马鱼在LRO中具有LR随机表达的Dand5。当斑马鱼LRO(1-4ss)发生初始对称性破坏时，在c21orf59敲击胚胎LRO左侧的1个体节阶段(1ss)之后，1个静止纤毛发生振荡偏转1小时(图4A至E)。钳夹后，将胚胎从显微镜下卸下，正常饲养至8-10ss，并通过原位杂交检测dand5的不对称表达。令人惊讶的是，机械刺激LRO左侧的单个纤毛足以挽救正确的右倾dand5表达(图4F)。

03
结语

本研究利用CiliaSPOT在斑马鱼LRO中的结论支持了另一篇研究文章中的小鼠LRO的结果。这两项研究都使用不同的实验模型和纤毛偏转方法，独立地研究了纤毛作为钙介导的机械传感器在LRO中的功能。尽管如此，本研究发现小鼠和斑马鱼LRO在纤毛机械感觉和纤毛内钙瞬变方面有惊人的相似之处，这强调了在纤毛LRO脊椎动物的LR发育过程中纤毛机械转导的进化保守机制。先前在小鼠和斑马鱼身上的有趣发现表明：缓慢、局部的LRO流动电流足以形成正常的LR模式，这说明后期快速、协调的LRO流动对于启动不对称并不是必不可少的。本研究表明，机械刺激LRO中的单个纤毛长时间是分子和心脏不对称的决定性因素，解决了先前的差异。这些发现表明，纤毛机械感知是发育和疾病中一种基本和有效的细胞信号机制，因为一个纤毛细胞足以造成手性脊椎动物的不对称。最后，除了生化和分子机制外，单细胞和细胞器水平上的微小物理力量在形成发育中的胚胎的双侧身体方面起着重要作用。

原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.abq7317