Life Med | 丁秋蓉等发表肝纤维化单细胞组学的研究综述

Original 生命·医学老顽童说

肝纤维化是一个高度动态和复杂的过程，它推动慢性肝病向肝衰竭和终末期肝病发展。尽管进行了几十年的不断探索，但肝纤维化发生的细胞和分子机制仍然难以捉摸，目前临床上尚无有效方法治疗肝纤维化。近日中国科学院上海营养与健康研究所丁秋蓉研究员团队在Life Medicine发表综述文章“Decoding liver fibrogenesis with single-cell technologies”。该文章系统总结了近两年基于scRNA-seq技术针对肝脏纤维化研究的新发现，重点讨论了与纤维化疾病相关的细胞亚群、分子事件和细胞间的相互作用，并展望了通过靶向肝纤维化过程中特定的细胞亚群及其病理生理变化开发有效治疗方法的新策略。

肝纤维化的主要特征是细胞外基质蛋白(ECMs)的过度积累，进而形成纤维瘢痕。一般认为导致肝脏中ECMs过度分泌的主要细胞是被激活的成纤维肌细胞。然而，导致肌成纤维细胞激活的事件通常涉及肝组织中的多种细胞亚群，包括肝细胞、免疫细胞和内皮细胞，以及其中复杂的相互作用。肝纤维化生态位（niche）是在慢性损伤后形成的，包含细胞成分和细胞外基质，如多种非肝实质细胞类型(NPCs)，复杂分布的ECMs和其他环境因子。近年来，许多肝脏scRNA-seq研究致力于研究不同疾病条件下的纤维化生态位，以期开发有效的肝纤维化治疗策略。该综述主要围绕针对肝纤维化发生过程中肝实质细胞、内皮细胞、星状细胞、巨噬细胞等细胞类型的特征性改变展开。

（一）肝实质细胞

前期多个研究发现哺乳动物肝脏中的肝实质细胞不是一个同质群体，每个肝细胞都被高度可变的微环境所包围，存在“肝细胞分区”。近来的scRNA-seq研究同样揭示了肝细胞在肝损伤或饮食干预或纤维化情况下存在分区差异。在高脂饮食(HFD)小鼠中，中心周肝细胞脂质形成基因(如Plin2、G0S2、Cd36)表达上调，脂质积累增多；而门脉周围肝细胞葡萄糖代谢相关基因表达增加(如Fbp1、Aldob)。对野生型小鼠肝脏的空间单细胞代谢组学(spatial single nuclear metabolomics, SEAM)分析显示，仅中心静脉区域肝实质细胞的代谢物存在明显的梯度区域分布。此外，通过对人纤维化肝组织的SEAM分析发现纤维化生态位附近的肝实质细胞具有特定的代谢物特征和转录组特征，提示纤维化生态位可以影响细胞的代谢稳态和基因表达。

图1. 纤维化肝细胞的scRNA-seq分析

（二）肝内皮细胞

LSECs是高度特化的内皮细胞，通过对肝纤维化肝脏内皮细胞的scRNA-seq分析研究发现，在AMLN饮食诱导的纤维化小鼠中，存在四组不同的内皮细胞，包括门脉周围(Wnt9b, Rspo3, Cdh13和Wnt2高表达) 和中心周 (Ednrb、Jag1、Lrg1、Efnb1、Ltbp4和Adgrg6高表达) 内皮细胞，以及两簇肝窦内皮细胞LSECs (Fcgr2b和Gpr182高表达)。同时，分析发现在人肝纤维化组织中存在两个和疤痕高度相关的内皮细胞群，而在CCL4诱导的小鼠肝纤维化组织中发现一个和疤痕高度相关的内皮细胞群。进一步研究表明在人和小鼠中，来自纤维化肝脏的内皮细胞跟脂质代谢和趋化因子释放相关的基因表达增加，而在血管发育和内稳态方面的基因表达减少，提示其与血管发育及稳态维持的相关功能可能发生失调。

图2. 肝纤维化肝脏内皮细胞的scRNA-seq分析

（三）肝星状细胞

成纤维肌细胞的主要来源是肝内活化的肝星状细胞 (HSCs) 和活化的门脉成纤维细胞。有意思的是，在人和小鼠中观察到明显的HSC功能分区，据此将HSC分为门静脉HSC (PaHSCs，高表达Ngfr) 和中央静脉HSC (CaHSCs，高表达Adamtsl2)。急性CCL4损伤导致CaHSCs和PaHSCs之间增殖水平相似。然而，在急性CCL4损伤后，只有CaHSCs表现出明确的向致病性胶原产生细胞发生转变。值得注意的是，编码溶血磷脂酸受体1的Lpar1基因在产生胶原的HSC亚群中有特异性表达，可能成为抑制此类HSC活化和胶原产生的潜在靶点。同时，在AMLN饮食诱导的小鼠NASH模型研究中发现，在肝纤维化过程中，肝星状细胞通过分泌“stellakines”响应肝内信号，并作用于内皮细胞、巨噬细胞、T细胞、树突状细胞等细胞，影响其属性的转变，提示星状细胞这肝纤维化发生过程中可能起关键的信号传导中枢的作用。进一步研究发现，肝星状细胞stellakine的分泌部分受其自分泌的IL11信号调节，在肝纤维化过程中形成正反馈，促进了stellakine的分泌。

图3. 纤维化肝脏中肝星状细胞 (HSCs) 的scRNA-seq分析

（四）肝巨噬细胞

肝巨噬细胞由制作卵黄囊或胎儿肝脏胚胎前体的组织驻留库普弗细胞 (resKCs) 和骨髓来源单核招募的巨噬细胞 (MDMs) 组成。MDMs被认为是肝纤维化的关键诱导因子TGFβ的主要来源。在肝纤维化发生的炎症条件下，一方面驻留库普弗细胞 (resKCs) 的自我更新和存活严重受损。在小鼠中，发现了两种不同的resKCs，主要群体为CD206^lowESAM^-，次要群体为CD206^hiESAM⁺。后者可能导致与肥胖相关的肝脏氧化应激。而研究发现KCs的发育和维持受KCs与星状细胞之间的ALK1-BMP9/10配体-受体对的调控。另一方面，肝纤维化发生过程中骨髓来源的MDMs从外周进入肝脏并扩大肝巨噬细胞池，在纤维化肝脏中浸润增加。一些新招募的MDMs获得了与resKC相似的表型，因而被定义为moKCs。除了moKCs，研究发现被招募到肝脏的部分单核细胞可分化为一种表达高Cd9、Trem2和Gpmnb的独特的巨噬细胞子集，称为脂类相关巨噬细胞（lipid associated macrophages, LAMs）。此类脂类相关巨噬细胞在空间上被发现更倾向于定位在肝纤维化区域或脂质变性区域，具有特定的免疫应激基因表达谱，Osteopontin高表达，同时含有较少脂滴积累。但此类巨噬细胞与肝纤维化发生的功能关系还有待进一步研究。

图4. 纤维化肝脏巨噬细胞的scRNA-seq分析

总之，基于scRNA-seq技术的研究已经在肝脏生理和病理方面取得了前所未有的发现，新鉴定的细胞亚群，以及和肝纤维化相关的特异性改变为更深入理解肝纤维化的发生基础提供了重要的资源。未来的努力将是在更多组学技术发展的基础上，充分整合针对肝纤维化发生过程中不同层面、不同阶段的特征刻画，全面了解肝纤维化过程中细胞亚群或细胞状态的特定改变，及其对肝纤维化发展的功能贡献，并将此类发现转化为有效的治疗方法。

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作者简介

周婷婷

中国科学院

上海营养与健康研究所

现为中国科学院上海营养与健康研究所在读博士生，目前研究方向为巨噬细胞对机体代谢紊乱的影响。荣获2019年中国科学院三好学生和优秀学生干部，2020年国家奖学金等荣誉。

丁秋蓉

中国科学院

上海营养与健康研究所

2004年获南京大学学士学位，2010年获中科院上海生命科学研究院博士学位。2010-2014年在美国哈佛干细胞研究所、美国哈佛干细胞与再生生物学系从事博士后研究。2014年末加入中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所（现上海营养与健康研究所）任研究员，获得国家海外高层次人才引进计划（青年项目）资助。主要研究方向聚焦肝脏脂质代谢稳态的生理功能及其失调的病理发生机制，致力于结合干细胞生物学和基因编辑技术建立干细胞疾病模型和大规模药物筛选，探索脂肪肝、肝纤维化等严重肝病的致病机理以及新的治疗方案。主要研究成果以通讯作者发表在Nature metabolism，Journal of hepatology, Cell reports, Stem cell reports等期刊。现为中国老年学和老年医学学会抗衰老分会委员、中国生物化学与分子生物学代谢分会委员、上海生物化学与细胞生物学会理事、和中国营养学会营养转化医学分会委员。

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