“揭榜挂帅”项目动态 | 林世贤团队报道氨基酰化赖氨酸的泛素化修饰的发现、机制和功能
该研究首先关注了赖氨酸的氨基酰化修饰（Lysine aminoacylation）。这一翻译后修饰是内源的氨酰-tRNA合成酶将20种天然氨基酸的α-羧基以异肽键的形式共价连接至底物蛋白赖氨酸的ε-氨基上而形成的。氨基酰化修饰能将赖氨酸的ε-氨基转变为相连氨基酸的α-氨基，而α-氨基有着更低的酸解离常数（pKa）与更强的化学反应活性，从生化原理上看，有被进一步修饰的潜力。例如，有多种发生于蛋白质N端α-氨基的翻译后修饰已被报道。抱着这一设想，研究团队开始尝试去探索可能存在于蛋白内部α-氨基的新型翻译后修饰。然而，20种氨基酰化修饰的化学结构非常类似而且氨酰-tRNA合成酶是细胞内的必需基因，因此难以用传统的生化或遗传方法研究这一问题。
该研究提出了利用遗传密码拓展技术的研究策略，通过化学合成结构明确的氨基酰化赖氨酸作为分子探针，并将其位点特异性地引入到蛋白质中，用于探索其被进一步修饰的形式（图2）。为了获取大量带有新型修饰的样品，论文随后使用了位置特异性引入非天然氨基酸的随机正交解码技术（Stochastic orthogonal recoding of translation, SORT），将甲硫氨酰化赖氨酸（MetK）展示在蛋白质组上作为诱饵探针。甲硫氨酸是蛋白质氨基端的起始氨基酸，存在着天然的翻译后修饰，通过将其大量展示在蛋白中间区域，可实现对未知翻译后修饰的富集和捕获。结合高效液相色谱-质谱分析，研究团队发现了一类发生在蛋白质内部α-氨基上的新型翻译后修饰——氨基酰化赖氨酸的泛素化修饰（K-XUb修饰）。
随后，论文利用抗体对细胞内源的新型泛素化修饰进行富集，并用高分辨质谱解析K-XUb修饰的分布规律。通过分析Ubisite抗体富集产生的质谱数据库，论文在Hep2和Jurkat细胞系中发现K-XUb修饰存在于1217个底物蛋白的2055个修饰位点上。对修饰类型的分析发现20种氨基酰化赖氨酸上均能发生K-XUb修饰。同时，鉴定到的修饰位点数量与α-氨基的酸解离常数（pKa）存在较好的相关性。这些结果表明氨基酰化赖氨酸的α-氨基可发生泛素化修饰。
研究团队利用遗传密码扩展技术在蛋白质和蛋白质组上分别引入氨基酰化赖氨酸（PraK）及其不含α-氨基的类似物（AlkK）（图2），结合体内泛素化实验，探索K-XUb修饰对底物蛋白降解的影响。研究发现在多个蛋白质中，相比于引入不含α-氨基类似物的对照组，引入氨基酰化修饰能显著提升底物蛋白的降解活性。进一步的定量分析实验表明，K-XUb修饰能够在多个底物蛋白质和蛋白质组的水平上促进底物的快速降解，且其降解速率显著快于经典赖氨酸泛素化介导的蛋白质降解。而且，蛋白酶体抑制剂MG132与Bortezomib均可不同程度地抑制该修饰介导的底物降解，表明加速降解过程同样利用了泛素-蛋白酶体系统。
最后，研究团队利用亲核活性实验对所有的泛素结合酶（E2）进行筛选，以探究氨基酰化赖氨酸的泛素化修饰的产生机制和特异修饰酶（Writer）。经过系统的体外生化实验与质谱分析，他们发现仅有UBE2W能特异地催化氨基酰化赖氨酸的泛素化连接而对赖氨酸无催化活性。同时，在活体细胞中对UBE2W进行敲降后，蛋白质组的K-XUb修饰水平显著降低。体外和细胞内的实验都证明了UBE2W是K-XUb修饰的特异Writer（图3）。值得注意的是，此前有报道UBE2W依靠其独特的C端结构域识别并催化底物蛋白柔性N端的泛素化修饰，而本研究证明了UBE2W同时也能催化蛋白质内部α-氨基的泛素化修饰，揭示了UBE2W催化内部α-氨基形成分叉肽键的独特催化活性。
总的来说，该论文利用遗传密码扩展策略引入氨基酰化修饰作为化学探针，首次鉴定了UBE2W介导的K-XUb修饰，区别于经典的赖氨酸的泛素化修饰，K-XUb修饰发生在20种氨基酰化赖氨酸的α-氨基上，并且在蛋白质和蛋白质组上都能显著加速蛋白酶体依赖的降解过程。论文进一步发现了赖氨酸氨基酰化修饰和泛素化修饰的相互作用规律，丰富了人们对泛素化修饰的类型、机制和功能的认识，显著拓展了蛋白质泛素化修饰的研究边界。另外，论文还证明了遗传密码扩展技术等化学生物学工具可应用于发现细胞中的新型翻译后修饰并能精准、高效地研究新修饰的产生机制和生物学功能。
据悉，博士生臧佳和陈宇霖是论文的共同第一作者，林世贤研究员是本文的通讯作者。林世贤实验室（链接http://lsi.zju.edu.cn/25713/list.htm）聚焦于整合化学和生物学科的交叉研究手段，探索tRNA和蛋白质修饰的生物学功能和工程改造，并基于此开发新型生物医药，用于重大疾病和罕见遗传病的诊疗。