NAR︱任艾明团队揭示新型NAD+-II核开关结构与作用机制

撰文︱许笑晨，李春燕责编︱王思珍，方以一编辑︱杨彬薇

核开关（Riboswitch）是一类参与基因调控的保守的非编码RNA分子，主要存在于细菌的5′端非编码区。这类RNA元件由识别模块（sensor domain）和表达平台（expression platform）组成，前者可以特异性得识别相应的配体并诱导自身及下游表达平台发生构象改变，从而在转录或翻译水平上抑制关闭或促进开启下游基因的表达。目前已经鉴定出的核开关超过55种。任艾明团队长期以特定RNA分子（核酶、核开关以及RNA适配体）三维精细结构为基础探讨其作用机制与功能的关系。在核开关研究中，该团队主要集中在与代谢相关的重要辅酶因子类核开关上，包括与S-腺苷蛋氨酸(SAM)代谢相关的SAM-VI核开关[1]，与嘌呤代谢相关的黄嘌呤核开关[2]，以及与NAD⁺代谢相关的NAD⁺-I类核开关[3]等。这些核开关参与代谢并维持相关辅酶因子细胞内浓度，对维持细胞功能至关重要。

2023年1月5日，浙江大学任艾明课题组与奥地利因斯布鲁克大学Ronald Micura课题组合作在Nucleic Acids Research杂志上发表题为“Structure-based investigation of NAD⁺-II riboswitch”的研究论文，报道了第二类特异性结合烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）的天然核开关pnuC motif的三维结构，揭示了一种全新的、与NAD⁺-I类核开关完全不同的配体识别方式与机理。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD⁺）(图1A)，是生物体内的一类重要代谢物，具有独特的电子传递特性，并作为一种通用的细胞电子转运体参与许多重要的氧化还原反应。2020年该团队对一类保守的由两个几乎相同的识别模块串联组成的能够特异性识别NAD⁺的RNA结构域（NAD⁺-I类核开关）进行研究，解析了这类核开关三维精细结构，阐释了其特异性识别NAD⁺的ADP部分的结构基础，并基于两个识别模块与配体的亲和力不同，结合相关生化实验，建立了NAD⁺-I类核开关调节基因表达的双浓度传感器模型[3]。

近期，Ronald Breaker课题组报道第二类可以选择性结合NAD⁺的pnuC RNA结构域——NAD⁺-II类核开关。进一步分析显示，NAD⁺-II类核开关与NAD⁺-I类核开关完全不同，特异性识别NAD⁺中的NMN部分。二级结构表明pnuC motif由两个茎区 P1和P1a 以及连接茎区的junction连接环组成，而这个junction连接环上的部分碱基又可以与3′末端形成假结结构[4](图1B)。

为了揭示NAD⁺-II类核开关的三维精细结构折叠规律和配体特异性识别模式，任艾明课题组利用X-射线晶体学的方法解析了pnuC RNA与NAD⁺的2.2 Å复合物晶体结构以及与NMN的2.5 Å复合物晶体结构。复合物的三维结构显示，NAD⁺-II类核开关整体折叠为一个“Y型”构象，茎区P1，假结茎区PK在三维空间中由连接区J1和3’末端J1K连接，形成空间上连续堆积的长螺旋轴，茎P1a从连接区J1和JK伸出，垂直于主螺旋轴(图1C)。与预测的二级结构相同，J1中的U12、C13、C14与J1K的最后三个核苷酸G59、G60、A61形成远程相互作用--假结茎区(PK)，维持了核开关整体结构的稳定和结合口袋的形成。NAD⁺结合在茎P1、 J1和茎P1a的连接交叉处，与NAD⁺-I类核开关识别NAD⁺的ADP部分正相反，NAD⁺中的NMN部分深埋在由NAD⁺-II类核开关茎P1，P1a和PK形成的致密口袋中，其本身与J1K中的C54和J1中的G41形成直接的氢键相互作用，堆叠在四碱基平面G6-U7-C40-A55和三碱基平面C5-G42-A53之间(图1D, E)。NAD⁺的ADP部分位于茎P1的主链侧，腺苷部分则指向外部，与J1的核苷酸堆积在一起，并且在一个非对称单元的两个分子中呈现不同的构象。基于结构，课题组对结合口袋中的关键碱基进行了特异性突变，随后通过ITC亲和力测定分析验证了这些结构。此外，研究者还利用2-Ap修饰RNA 分子的荧光光谱分析，进一步揭示了配体诱导的识别结构域折叠过程。

在NAD⁺-II核开关结合NAD⁺和NMN的结构中均可观察到结合口袋中的阳离子。为了研究二价金属离子对NMN结合能力的影响，研究者制备了Mg²⁺浓度范围为0 mM至20 mM的RNA样品，并进行等温滴定量热法。结果显示，Mg²⁺浓度低于1mM不足以结合配体。随着Mg²⁺浓度增加至20 mM，核开关与NMN之间的结合亲和力变得更高（5 mM Mg²⁺，K_d为247 μM; 10 mM Mg²⁺，K_d为76 μM; 20 mM，K_d为41 μM）。这些结果表明二价金属离子对配体结合的必要性。研究者认为Mg²⁺对于NAD⁺-II核开关的作用是多重的，既维持整体RNA折叠的稳定和结合口袋的形成，又对配体与RNA的结合具有重大贡献。

此外，研究者发现NAD⁺-II核开关的一个非对称单元中两个RNA分子的茎P1a显示出不同的方向，这表明茎P1a相比于其它部分具有更高的构象灵活性。NMN结合口袋是NAD⁺-II折叠核心的一部分，涉及J1和J1K，而茎P1a不直接参与配体识别。基于三级结构和识别口袋分析，研究者尝试删减茎区P1a来对天然pnuC RNA motif进行编辑(图1F,G)，并通过ITC证明截短的pnuC RNA motif保留了与原始的RNA相当的配体结合亲和力(图1H)，这表明天然RNA结构中存在部分可编辑的冗余结构。

图1 NAD⁺-II核开关的三维RNA结构及截短的pnuC RNA motif

（图源：Xu, X. et al., Nucleic Acids Res, 2023）

文章结论与讨论，启发与展望

本项研究解析了NAD⁺-II核开关与NAD⁺复合物的2.2 Å晶体结构和与NMN复合物的2.5 Å晶体结构，揭示了一种新型的具有NMN特异性结合口袋的RNA三维结构。通过体外的突变体亲和力验证以及动力学分析，研究者揭示了这类新型RNA分子与重要代谢物NAD⁺特异性结合的分子基础。此外，基于从三级结构和结构动力学获得的信息，研究者通过删除其中一个茎来进一步定制NAD⁺-II RNA，并证明NAD⁺-II RNA的截短版本保留了与野生型RNA相当的配体结合亲和力。这项工作也为重新设计和简化天然RNA分子提供了重要参考，这为开发以核开关为基础的传感器等作为生物技术工具的工程奠定了理论依据和结构基础。

原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkac1227

浙江大学任艾明团队

（照片提供自：浙江大学任艾明团队）

通讯作者简介（上下滑动阅读）

浙江大学任艾明团队主要专注于特定非编码RNA分子包括核开关、核酶和RNA适配体等的三维精细结构与作用机制研究。该项研究工作获得了国家自然科学基金（32022039, 31870810,  91940302, 91640104），国家重点研发项目（2021YFC2300300），浙江省杰出青年基金（LR19C050003）以及浙江大学中央高校基金科研项目业务费（2017QN81010）等项目的资助。团队正在招聘博士后，要求是 1）已获得（或即将获得）分子生物学、结构生物学或有机化学合成专业的博士学位；2）具有较强执行力和创新思维，能够在PI指导下开展独立研究工作；3）良好的团队合作意识和沟通能力，较强的中英文表达能力和阅读能力。感兴趣的申请人将个人的完整简历（如果有论文发表，请附全文）2名推荐人的姓名和联系方式，以及其它相关资料以PDF格式发送至 [e-mail]。

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参考文献（上下滑动阅读）

[1] Sun, A. et al. SAM-VI riboswitch structure and signature for ligand discrimination. Nat Commun 10, 5728, doi:10.1038/s41467-019-13600-9 (2019).

[2] Xu, X. et al. Insights into xanthine riboswitch structure and metal ion-mediated ligand recognition. Nucleic acids research 49, 7139-7153, doi:10.1093/nar/gkab486 (2021).[3] Chen, H. et al. Structural distinctions between NAD+ riboswitch domains 1 and 2 determine differential folding and ligand binding. Nucleic acids research 48, 12394-12406, doi:10.1093/nar/gkaa1029 (2020).[4] Panchapakesan, S. S. S., Corey, L., Malkowski, S. N., Higgs, G. & Breaker, R. R. A second riboswitch class for the enzyme cofactor NAD+. Rna 27, 99-105, doi:10.1261/rna.077891.120 (2021).
本文完