Autophagy︱新乡医学院王辉团队发现TRIM7通过调节自噬抑制李斯特菌感染的新机制

撰文︱秦  潇

责编︱王思珍，方以一

编辑︱杨彬薇

TRIM7 (tripartite motif containing 7)是E3泛素连接酶，该团队在先前的研究中发现TRIM7通过促进STING的K48连接泛素化修饰，进而抑制DNA病毒触发的固有免疫反应；另一方面靶向MAVS降解并负向调控对抗RNA病毒的抗病毒反应[1,2]。然而，TRIM7在清除胞内细菌中的作用尚不清楚。

李斯特菌(L. monocytogenes，Lm)是一种革兰氏阳性细胞内细菌，是一种食源性病原体，能够感染人类和其他动物物种。它会导致胃肠炎，可能并发菌血症和中枢神经系统感染，死亡率高达30%[3]。尽管李斯特菌被认为进化出了逃避细胞自噬监测的机制，但据报道，自噬在原发性感染的早期阶段限制了其细胞内生长[4]。TRIM家族的一些成员可与自噬相关蛋白相互作用并参与自噬小体的形成，TRIM7是否也在自噬过程中发挥一定的功能呢？目前还没有相关报道。

2022年12月21日，新乡医学院河南省免疫与靶向药物重点实验室王辉教授团队在Autophagy杂志发表了题为“TRIM7/RNF90 promotes autophagy via regulation of ATG7 ubiquitination during L. monocytogenes infection”的研究论文。该研究发现TRIM7分子作为细胞内细菌感染和自噬的一种新的调节因子，它具有针对ATG7的一种新的翻译后修饰。这项研究为深刻认识宿主抗细菌感染和自噬在细胞内细菌感染中的作用提供了理论依据。

作者之前的研究工作表明TIRM7参与调控抗病毒固有免疫反应，因此想进一步探索TRIM7是否在李斯特菌感染过程中也发挥着作用。作者首先检测了TRIM7在李斯特菌感染时的表达情况。发现用李斯特菌感染会促进TRIM7的表达(图1a)。接下来，作者使用TRIM7缺陷小鼠做了相关实验。与野生型小鼠相比，TRIM7缺陷小鼠在李斯特菌感染后存活率较低(图1b)。并且发现TRIM7缺陷上调了小鼠血清和各器官IFNB的水平(图1c,d)。此外，在肝脏和脾脏中，TRIM7缺陷小鼠李斯特菌感染加重(图1e)。综上所述，这些数据表明，尽管TRIM7缺陷增加了I型IFN的产生，但TRIM7缺陷小鼠对于李斯特菌的抵抗力降低。

图1 TRIM7保护小鼠免受李斯特菌感染

（图源：Wang J, et al. Autophagy, 2022）

接下来，作者在细胞水平上探讨了TRIM7的功能。在TRIM7 KO细胞中，李斯特菌数量增加（图2a-c）。同时，TRIM7的敲除或敲低增强了李斯特菌感染诱导的固有免疫反应，包括IFNB、CXCL10、IFIT1和TNF的产生，以及TBK1、IRF3和RELA的磷酸化(图2d-i)。接下来用STING缺陷型PMA-THP1细胞做了相关实验，发现虽然STING缺失导致李斯特菌感染升高，但TRIM7敲低对李斯特菌感染的增强并没有显著改变（图2j），提示TRIM7负调控李斯特菌感染不依赖于STING。这些结果表明，TRIM7缺失或TRIM7敲低均可增强李斯特菌感染和固有免疫反应。

图2 TRIM7对李斯特菌细胞感染有负向调控作用

（图源：Wang J, et al. Autophagy, 2022）

然后，为了探索TRIM7调控李斯特菌感染的潜在机制，作者进行了质谱分析，发现了自噬关键蛋白ATG7[5] (图3a)。为了进一步确定TRIM7和ATG7的相互作用，作者又进行免疫共沉淀实验、共聚焦实验、邻位连接技术(图3b-g)。接下来，作者探讨了TRIM7与ATG7相互作用的区域。发现只有全长TRIM7与ATG7具有相互作用(图3h,i)。且ATG7与TRIM7的C端结构域(CTD)或N端结构域(NTD)之间仅检测到非常弱的相互作用(图3j,k)。总之，这些结果表明TRIM7与 ATG7具有相互作用。

图3 TRIM7与ATG7相互作用

（图源：Wang J, et al. Autophagy, 2022）

鉴于TRIM7与自噬所必需的蛋白ATG7相互作用，而自噬在宿主防御细胞内细菌中起着重要作用，作者提出了TRIM7靶向ATG7调节自噬的假设。为了验证这个假设，作者检测了TRIM7在多种细胞中过表达、敲低或缺失对李斯特菌感染引发的自噬的影响，其中免疫印迹和共聚焦的结果均提示TRIM7在李斯特菌诱导的自噬中起正向调节作用(图4)。此外，使用巴弗洛霉素A1处理，来证明 TRIM7促进了李斯特菌诱导的自噬体积累，但不促进吞噬体-溶酶体融合或溶酶体降解(图4b)。综上所述，这些结果表明TRIM7促进了李斯特菌诱导的自噬体积累。

图4 TRIM7促进了李斯特菌感染诱导的自噬

（图源：Wang J, et al. Autophagy, 2022）

TRIM7是一种E3泛素连接酶，作者猜想TRIM7可能调控了ATG7的泛素化修饰。通过验证发现TRIM7仅增强了ATG7的K63连接泛素化(图5a)。TRIM7突变体C29、32A（E3酶缺陷）和∆R失去了这种作用(图5b)。通过检测ATG5-ATG16L1和ATG3-LC3之间的联系，发现TRIM7在自噬中正调控ATG7的功能 (图5c-f)。综上所述，这些研究表明TRIM7促进ATG7的K63连接泛素化修饰，调控ATG7的功能。

图5 TRIM7促进ATG7泛素化

（图源：Wang J, et al. Autophagy, 2022）

最后，作者确定了TRIM7催化ATG7泛素化修饰位点。作者通过对ATG7上的一系列赖氨酸进行点突变，发现ATG7 413位赖氨酸突变后，其不会被TRIM7泛素化修饰，也失去了促进自噬的能力(图6a-f)。考虑到ATG7的K413位点在小鼠中位于K409位点(图6b)，作者又在MEF细胞中做了相关研究。发现小鼠ATG7的K409R突变体同样不能抑制李斯特菌感染。在TRIM7缺失的MEF中，小鼠ATG7的野生型和K409R突变体对李斯特菌感染的作用没有显著差异，说明TRIM7对ATG7在K409位点的修饰非常重要(图6g)。这些研究结果表明TRIM7促进了ATG7在K413位点的泛素化，而该位点的泛素化对于ATG7在自噬和李斯特菌感染中的功能至关重要。

图6 TRIM7促进ATG7在K413的泛素化

（图源：Wang J, et al. Autophagy, 2022）

图7 TRIM7促调节自噬机制的工作模型

（图源：Wang J, et al. Autophagy, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究基于先前TRIM7在抗病毒固有免疫中的作用，探索了TRIM7对清除胞内细菌的作用，发现了TRIM7通过促进ATG7在K413位点的泛素化修饰，正向调控自噬体的积累，从而影响李斯特菌的感染。揭示了TRIM7是调节细胞内细菌感染和自噬的一种新的因子(图7)。但是，作者在筛选TRIM7结合蛋白实验中，使用的是未刺激的细胞样品，可能会漏掉一些靶分子；并且作者也没有在TRIM7缺陷细胞中检测ATG7的泛素化修饰情况，不能确定是否有其他E3分子也参与其中。总之，本研究能够拓展我们对宿主抗细菌防御和自噬在细胞内细菌感染中的功能的认识。

原文链接：https://doi.org/10.1080/15548627.2022.2162706

通讯作者：王洁（左），王辉（中），杨波（右）

（照片提供自：河南省免疫与靶向药物重点实验室）

实验室简介（上下滑动阅读）

河南省免疫与靶向药物重点实验室前身为2005年成立的新乡医学院免疫学研究中心，2009年被评为河南省高校重点学科开放实验室，2017年被河南省科技厅审批建设为河南省免疫与靶向药物重点实验室。实验室于2016年聘请一位法国科学院院士国际著名免疫学家为特聘教授，2018年和2022年分别获批一项国家高级外专人才项目。2020年获批国家免疫与模式动物高校创新引智基地（111计划）。实验室主要有免疫模式动物、感染免疫、代谢免疫和抗体药物研发四个研究方向，自主研发了新一代人源化小鼠，模式动物已服务数十家国内外知名科研院所，是河南省为数不多的具有技术和产品输出能力的机构。

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参考文献（上下滑动阅读）

[1] Yang B, Zhang G, Qin X, et al. Negative regulation of RNF90 on RNA virus-triggered antiviral immune responses targeting MAVS. Front Immunol. 2021;12:730483.

[2] Yang B, Liu Y, Cui Y, et al. RNF90 negatively regulates cellular antiviral responses by targeting MITA for degradation. PLoS Pathog. 2020;16(3):e1008387.

[3] Ogawa M, Yoshikawa Y, Mimuro H, et al. Autophagy targeting of Listeria monocytogenes and the bacterial countermeasure. Autophagy. 2011;7(3):310–314.

[4] Py BF, Lipinski MM, Yuan J. Autophagy limits Listeria monocytogenes intracellular growth in the early phase of primary infection. Autophagy. 2007;3(2):117–125.

[5] Collier JJ, Suomi F, Olahova M, et al. Emerging roles of ATG7 in human health and disease. EMBO Mol Med. 2021;13(12):e14824.

本文完