Nat Commun | 曾雷团队提出表观遗传调控基因激活的新分子机制
撰文︱梁莹莹责编︱王思珍，方以一编辑︱杨彬薇
染色质组蛋白乙酰化修饰是表观遗传调控基因表达激活的重要驱动之一[1]。p300/CBP是一种关键的组蛋白乙酰化转移酶（Histone Acetyltransferase, HAT），可促进组蛋白乙酰化以及调控基因转录激活。但令人费解的是，当p300/CBP到达染色质时，其通常处于一种“自我抑制”（auto-inhibition）的蛋白结构构象，尚不具有乙酰化修饰组蛋白的催化活性。然而在肿瘤中，是什么“开关”机制启动了p300/CBP的活化，进而导致异常水平的组蛋白乙酰化和癌基因转录激活，科研人员尚不十分清楚。
NUT癌（NUT carcinoma, NC）是一种罕见的高度侵袭性恶性肿瘤[2]。在NUT癌细胞中NUTM1基因与配体基因BRD4等融合，形成一种致癌的BRD4-NUT融合蛋白。作为一种转录调控因子（transcription regulator），BRD4-NUT主要富集于染色质上，招募并激活p300/CBP，进而驱动p300/CBP所介导的组蛋白超乙酰化（hyper-acetylation）和基因表达紊乱。因此，研究BRD4-NUT与p300分子间相互作用过程，有助于在蛋白质结构和分子机理上阐明实体肿瘤中p300变构激活以及染色质异常基因转录的基础机制。
2023年1月13日，吉林大学第一医院、吉林大学未来科学国际合作联合实验室曾雷课题组在Nature Communications上发表了题为“Structural Mechanism of BRD4-NUT and p300 Bipartite Interaction in Propagating Aberrant Gene Transcription in Chromatin in NUT Carcinoma”的研究。该研究揭示了BRD4-NUT双重结合及激活p300过程是导致染色质上组蛋白异常乙酰化和基因转录紊乱的关键。转录调控因子通过双重作用及招募p300的活化模式，是一种以前缺少认知的“开关”机制，具有增加组蛋白乙酰化及激活基因表达的普遍意义，为理解肿瘤细胞如何实现空间特异的基因激活机制提供了创新理论基础。
该研究通过GST-pulldown（图1a）和核磁共振（NMR）亲和力滴定实验（图1b），发现BRD4-NUT融合蛋白中的NUT部分包含了两个串联的反式激活域（transactivation-domain, TAD），均能有效地结合p300蛋白的TAZ2结构域（图1a和b）。该研究利用核磁共振（NMR）技术解析BRD4-NUT中两种TAD多肽结合p300蛋白TAZ2结构域的蛋白质分子复合结构。结果显示，TAD1和TAD2的结合基序，在结合到4-螺旋束TAZ2结构域中后，均形成a-螺旋折叠，并通过氨基酸残基疏水基团之间相互作用与TAZ2结合（图1c）。转录因子（transcription factor, TF）是一类能够与靶基因特异DNA序列结合的蛋白质，并与RNA聚合酶II形成转录复合体，在特定时空条件下调控靶基因的转录。多种转录因子中均包含了进化上保守的两个串联TAD，因此该研究通过对比BRD4-NUT和转录因子p53和p63中TAD关键氨基酸基序，发现它们的TAD结合序列和作用机制均显示保守一致（图1d），说明转录因子p53与BRD4-NUT在激活p300的功能方面具有相关性。
（图源：Yu D et al., Nat Commun, 2023）
在细胞核内，BRD4-NUT能够与p300，组蛋白H3乙酰化赖氨酸K27和K18，转录辅助因子BRD4L和BRD4S形成液态共凝聚物（图2a和2b）。然而，该研究发现，如果删除BRD4-NUT蛋白中单个或串联的TAD，删除突变体BRD4-NUT-DTAD1（或者-DTAD1、-DTAD1/2）明显减弱与p300、H3K27ac、H3K18ac以及BRD4L/S细胞核内共凝聚（图2a和b），说明BRD4-NUT协同地依赖其串联的TAD，双重结合两个p300蛋白分子，增强其与p300、乙酰化组蛋白以及转录调控因子的液态共凝聚。通过细胞内（图2c）和体外乙酰化实验（图2d）进一步证明，野生型BRD4-NUT-WT能够促进内源p300的自身乙酰化（auto-acetylation）和自身激活（auto-activation），并增加组蛋白赖氨酸乙酰化水平（H3K27ac、H3K18ac、或H3K56ac）（图2c和2d）。然而，删除一个或者两个TAD后，删除突变体BRD4-NUT-DTAD1（或者-DTAD1、-DTAD1/2）未见增加p300自身乙酰化和组蛋白乙酰化水平（图2c和2d）。这些数据表明，BRD4-NUT与p300之间的双重结合是协调促进染色质p300的HAT反式激活（trans-activation）及其所介导的组蛋白H3超乙酰化的关键。
（图源：Yu D et al., Nat Commun, 2023）
值得注意的是，多种转录因子（如p53）均包含与p300/CBP相互作用的串联TAD，并协同地激活基因转录。为进一步研究转录因子中的串联TAD是否与p300双重结合并激活p300，该研究设计了p53蛋白TAD删除突变体（p53-DTAD1、-DTAD2或-DTAD1/2）。该研究发现，在HEK293T细胞中，转染的野生型EGFP-p53-WT能结合内源p300，但单或双TAD删除的p53突变体未见明显结合p300。此外，在细胞内和体外乙酰化实验中，EGFP-p53-WT（而不是其TAD删除突变体）均增加内源p300自身乙酰化激活、p53乙酰化、以及H3K18ac、H3K27ac或者H3K56ac乙酰化水平（图3a和b）。这些结果表明，p53蛋白依赖于其串联的TAD与p300形成双重相互作用，促进p300和p53激活以及增加组蛋白乙酰化水平。
（图源：Yu D et al., Nat Commun, 2023）
（图源：Yu D et al., Nat Commun, 2023）
综上所述，该研究发现BRD4-NUT中的NUT部分包含两个串联的TAD，可以分别结合两个p300蛋白分子。当与p300的TAZ2结构域结合时，这两个TAD均形成a-螺旋折叠结构。BRD4-NUT双重结合p300可能降低了TAZ2结构域对HAT活性的自身抑制，改变了p300蛋白分子自身抑制的空间构象，导致p300的反式自乙酰化，进而变构激活p300。p300自身激活后，催化组蛋白乙酰化修饰，导致基因异常转录，促进肿瘤细胞的生长（图4）。这种激活模式适用于p53串联TAD与p300的双重相互作用。该研究所揭示的激活模式，与p300蛋白TAZ2结构域与二聚化转录因子（如STAT1和IRF3）的结合并激活的机制有一定联系。值得注意的是，近期报道突出了p300蛋白中TAZ2结构域对p300 HAT活性的自我抑制功能的重要性，例如，在许多人类癌症中发现的p300/CBP的TAZ2缺失突变体与染色质中H3K27和H3K18处的组蛋白乙酰化（p300/CBP的两种已知底物）和鳞状细胞癌患者放疗后复发相关。此外，该研究BRD4-NUT与p300双重结合促进在调控基因异常转录中，需要进一步实验研究相关癌基因的异常转录扩增，验证癌基所驱动的肿瘤发生发展中相关生物学表现。总之，该研究首次发现BRD4-NUT双重结合及招募p300的活化模式，并且解析了BRD4-NUT和p300相互作用的结构机制，对调控基因表达激活具有普遍意义，为理解肿瘤细胞空间特异的基因激活机制提供了新方向。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-36063-5
吉林大学第一医院博士研究生喻笛和梁莹莹为论文共同第一作者，吉林大学第一医院、吉林大学未来科学国际合作联合实验室曾雷教授，美国纽约市伊坎-西奈山医学院Ming-Ming Zhou教授为论文共同通讯作者。
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参考文献（上下滑动阅读）
[1] Strahl BD, Allis CD. The language of covalent histone modifications. Nature. 2000;403(6765):41-45. doi:10.1038/47412
[2] Lantuejoul S, Pissaloux D, Ferretti GR, McLeer A. NUT carcinoma of the lung.Semin Diagn Pathol. 2021;38(5):72-82. doi:10.1053/j.semdp.2021.06.005
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