撰文︱李德宝，叶霖财
点评专家︱刘锦纷（教授，国家心血管病中心先心病主任委员）肺静脉狭窄（PVS）是先天性心脏病中最具挑战性的临床问题之一，可导致继发性肺动脉高压和右心室（RV）肥厚，患儿两年内死亡率高达60%[1]。PVS有两个重要的特点，使其治疗极具挑战性：(1)肺静脉广泛性内膜增生，从狭窄处一直延伸至上游小血管；(2)肺静脉狭窄外科手术后患儿仍面临较高的再复发率，需要多次手术干预[2，3]。目前PVS仅有大型动物模型，如小型猪。由于缺乏合适的小动物模型，PVS恶性进展或复发的机制尚不清楚，导致尚无有效的治疗方式和药物干预的靶点[4，5]。本研究建立了一种新生大鼠PVS模型，为理解PVS发病机制，寻找干预靶点以及开发潜在的治疗方法提供了研究平台。2023年6月19日，国家儿童医学中心（上海儿童医学中心）叶霖财课题组孙琦、张浩、仇黎生、洪海筏、李德宝、陈浩、赵沛斌、肖颖颖、叶霖财在美国华人医学会会刊Cell and Bioscience上发表了题为“A neonatal rat model of pulmonary vein stenosis”的研究。该研究在国际上首次成功建立了新生鼠PVS模型。该模型具有与临床PVS患儿类似的病理生理变化，为今后研究人员探索PVS进展和复发的机制提供了研究平台。为了模拟PVS，研究团队对出生24h内新生鼠进行肺静脉环缩手术。研究者首先通过低温麻醉新生鼠，造成心脏停搏和可逆性呼吸暂停，以防止在手术过程中过度失血。然后将将新生鼠转移到冰床上维持麻醉，以仰卧位固定于体式显微镜下。术中应用正中横向切口开胸，暴露右肺静脉（图1a），并用28G针头进行环缩（直径为0.35mm），术后关胸并恢复乳鼠体温（图1b, c）。通过该方法建模术后死亡率低于5%，但PVS组幼鼠体重显著低于假手术（sham）组（图1d）。肺动脉高压（PAH）是PVS最常见的并发症，在心动超声图表现为PA加速时间减少，研究人员在幼鼠出生后21天（P21）检测了PA加速时间来评估PAH和PVS。结果显示，PVS组的加速度时间显著缩短。相应地，肺动脉血流脉冲图像变为像“刀背”一样的形状（图2a-c）。除了心超外，研究团队还应用micro-CT测量P21天大鼠环缩处肺静脉直径，结果显示PVS组右肺静脉起始处肺静脉直径显著低于sham组。以上结果提示肺静脉环缩术构建成功，术后肺静脉显著狭窄。为了继续评估幼鼠PVS后的组织学和病理生理学变化是否与人类PVS患儿一致，研究人员首先评估了肺大体的情况，结果显示，PVS组右上、中叶存在肺充血，而sham组无明显肺充血（图3绿色箭头）。接着，研究人员检测了PVS上游肺静脉的内膜增生情况，研究人员发现PVS模型组在P21时，平滑肌层的厚度明显增加，上游肺静脉内膜显著增厚，（图4a-e, 红线）。为了评估重塑肺静脉中的弹性纤维和胶原纤维的表达情况，研究者进行了EVG染色和Masson染色，结果显示PVS组肺静脉弹性纤维和胶原纤维的表达较sham组显著上升（图5a-e）。这些结果提示，PVS引起血管平滑肌层变厚，胶原纤维和弹性纤维表达增加。图5 PVS组肺静脉弹性纤维和胶原纤维的表达较sham组显著上升。为了进一步表征上游肺静脉增厚的细胞类型，研究人员采用α-SMA和cTnT免疫荧光染色来区分平滑肌细胞和心肌细胞。结果显示，PVS组显示平滑肌层厚度增加，管腔变窄（白色箭头）。而WGA和cTnT染色显示，两组间心肌细胞大小和心肌层厚度无差异（图6a-e）。这些结果提示内膜增生是平滑肌层增厚，而不是心肌细胞层。研究团队接着评估肺的组织学变化。结果显示，相较于sham组，PVS组的小血管中有明显淤血（图7a红色箭头）。这与大体肺样本检查结果一致（图3a和b，绿色箭头）。此外，PVS组的肺泡数量显著减少（图7a和b），提示PVS损害了出生后的肺泡发育。在PVS组中也发现了肺小血管壁厚的增加（图7c和d），肺小血管的α-SMA强度增加（图7e和f）。这些结果均表明，PVS引起了广泛的肺小血管重构，这可能是PAH的原因。最后，研究者评估了右心室的组织学变化。结果显示，PVS组右心室游离壁厚度较sham组明显增加，右心室心肌细胞的大小也显著增加（图8a-d）。这进一步表明了PVS引起了PAH进而导致右心室重构。然而，PVS组右心室胶原蛋白含量与sham组相比并无显著差异（图8e, f），这可能是因为新生儿心脏具有较强的代偿能力，压力负荷情况下很少引起纤维化。综上所述，该研究成功建立并评估了新生鼠PVS模型。与临床PVS患儿类似，PVS鼠也显示出广泛的肺静脉内膜增厚和继发性PAH。该模型将促进研究人员对PVS进展和复发的理解，并改善其治疗。与以往常用的PVS仔猪模型相比，大鼠模型有几个优点： (1)建立一只新生大鼠PVS模型不超过10 min，饲养大鼠的空间较小，繁殖时间较短，因此时间和经济要求较低；(2)只需要一个熟练的外科医生或学生即可完成建模，而仔猪PVS模型需要一整个外科团队；(3)啮齿动物更容易进行基因层面检测和药物评估。
该研究也存在一些局限性。首先，水平开胸术造成较大创伤，并且还会损害辅助呼吸的肌肉。未来应该研究更为微创手术方法。其次，尚缺乏对该模型进行长期评估。另外，环缩直径的大小是否影响PVS的进展也尚未确定。
未来，研究者将尝试构建PVS新生小鼠模型，并结合谱系追踪实验，以帮助确定PVS内膜增生的肌成纤维细胞来源，将进一步推进研究人员对PVS的理解。
专 家 点 评
刘锦纷，教授，国家心血管病中心先心病主任委员
肺静脉狭窄（PVS）是儿童先心病领域最难以克服的临床难点之一，患儿死亡率极高，心脏科的规培医师或者实习生经常被上级医师告知肺静脉狭窄基本是一种绝症。叶霖财团队构建的新生鼠PVS模型为PVS发病机制的研究提供了基础平台，有望推动PVS研究和治疗的进展，最终克服PVS难以治愈的问题，期待该模型为PVS患儿带来福音。新生鼠PVS模型的构建需要较高的心脏显微外科技术。国家儿童医学中心（上海儿童医学中心）数十年深耕于鸡蛋大小的新生儿心脏，积累了丰富的心脏显微外科的经验，创造了多个国内儿童先心病治疗的第一，如最小体重、最复杂先心手术和最早的儿童心肺机等。叶霖财团队借助的国家儿童医学中心（上海儿童医学中心）心脏中心的平台，是模型研发的客观基础，也是将来临床转化的优势。
原文链接：https://cellandbioscience.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13578-023-01058-8
上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心硕士研究生李德宝为本文第一作者，心胸外科仇黎生教授，洪海筏教授为共同第一作者，心胸外科/心研所叶霖财副研究员为通讯作者，心胸外科孙琦教授和张浩教授为共同通讯作者，上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心为本文第一单位。该工作获得了国家重点研发计划（2019YFA0110401）、国家自然科学基金（82270314,82200309,和82001835)），上海市科委基金（22ZR147900 和23ZR1441100）和宁波市高端医疗团队创新计划（2022020405）等资助。通讯作者简介：叶霖财，副研究员，在哈佛医学院/波士顿儿童医院师从国际著名的心血管病专家William Pu教授，从事了两年时间的访问学者学习，在婴幼儿先心病方面积累了较丰富的经验，近5年以第一或通讯作者(含共一和共通讯）发表SCI论著15篇，包括心血管专业的权威期刊（Circulation，JACC Basic Transl Sci，JAHA和JTCVS）；授权发明专利7项；负责国家自然科学基金2项、上海市科委创新行动计划和上海市自然科学基金（原创探索类）等项目，是国家重点研发计划子项目（编号：2019YFA0110401）的课题骨干。点评专家简介：刘锦纷，教授、博士生导师，从事先天性心脏病的临床和基础研究，主刀各种先心病手术5000余例，现任国家心血管病中心先心病主任委员，上海市结构性心脏病虚拟现实工程技术中心主任，国务院特殊津贴获得者，获上海市医学会“杰出贡献奖”和国家科技进步二等奖等奖励。原世界小儿心脏外科协管理委员会委员、中华小儿外科常委心胸学组组长。主持完成国家重大科学研究计划、上海市科委基础重点项目/重大项目、国家自然科学基金等项目。
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