胆管良性狭窄临床多见，常由胆囊切除术、慢性胰腺炎等多种原因引起，长期的胆管梗阻会导致胆管反复感染，引起胆管结石和肝功能损害，甚至诱发胆管癌。胆管良性狭窄的主要治疗目标是解除胆管梗阻，实现胆管长期通畅。内镜下胆管扩张联合支架置入是胆管良性狭窄的首选治疗方法，指南推荐需要维持治疗至少1年。目前临床上常用的胆管支架多为不可降解的塑料支架或金属支架，除了需要反复拔除和更换外，还存在再狭窄率高、移位率高等不足。生物可降解胆管支架的出现解决了上述不可降解胆管支架的不足，具有明显的优势。但是，目前的生物可降解胆管支架，由于降解速度过快、治疗作用单一、再狭窄发生率较高等不足，尚未得到临床广泛应用。近期，陆军军医大学新桥医院消化内科樊超强教授、杨仕明主任团队和加拿大曼尼托巴大学邢孟秋院士团队合作，作为封面文章在Advanced Science(IF=15.1)上发表题为“Biosynthetic Plastics as Tunable Elastic and Visible Stent with Shape-Memory to Treat Biliary Stricture”的研究。该研究利用生物合成塑料---聚3羟基丁酸酯-co-4羟基丁酸酯[P(3HB-co-4HB)]，首次设计并构建了一种新型可降解胆管支架。该支架具有良好的生物相容性、可调控的力学性能和形状记忆性能，以及载药/缓释作用。通过内镜技术顺利将该支架置入大型动物胆管狭窄模型，验证了其良好的治疗效果。为生物可降解支架治疗胆管狭窄提供了新的思路。
图1. Advanced Science文章封面图
1. P(3HB-co-4HB)的生产及理化性能研究通过苏丹黑染色可以观察到P(3HB-co-4HB)颗粒在细菌胞内的积累，并通过透射电镜得到了证实（图2A）。不同底物生产的P(3HB-co-4HB)的重均分子量（Mw）、数均分子量（Mn）、拉伸强度（Tensile strength）、断裂伸长率（Elongation at break）、熔化温度（Tm）及分解温度（Td）见表1和图3。鉴于d材料同时具有较好的断裂伸长率和拉伸强度，作者选择了材料d用于后续的实验研究。
表1. 不同单体比例的P(3HB-co-4HB)的理化性质
图3. P(3HB-co-4HB)的制备及其理化性质采用CCK-8法评价P(3HB-co-4HB)对3T3细胞及小鼠肝外胆管上皮细胞的毒性，可以看到实验组与对照组的细胞在增殖数量上随着时间的推移无明显差异(图4A)。将P(3HB-co-4HB)膜置于大鼠皮下后形成了组织包被(图4C)。经组织学观察，1个月时，可见植入的膜片引起了局部组织炎症反应；3个月时，可见局部炎症反应显著减轻；6个月时，局部炎症反应进一步减轻。上述结果提示P(3HB-co-4HB)具有良好的生物相容性。
图4. P(3HB-co-4HB)的生物相容性
3. P(3HB-co-4HB)的载药、可视化及降解性能研究传统支架的主要功能是机械支撑，不能抑制局部纤维组织增生，因此，支架置入后的再狭窄发生率较高。理想的支架可以达到局部狭窄支撑和局部药物治疗的双重作用。作者通过在支架负载曲安奈德用于狭窄的病因治疗。曲安奈德是临床上常用的类固醇激素，具有很强的抗炎作用，可以抑制成纤维细胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成。曲安奈德是一种脂溶性药物，通过添加聚乙二醇（PEG）增加亲水性后药物释放得到了提高。5% PEG、10% PEG和15% PEG对药物释放的改善效果相似（图5B-b2）。P(3HB-co-4HB)材料的断裂伸长率随PEG浓度的增加而增加，而拉伸强度则下降（图5D）。当PEG含量增加到10%时，断裂伸长率增加，但拉伸强度明显下降。随着PEG含量的增加，构建的支架的支撑力逐渐减小(图5E)。因此，作者使用5% PEG-P(3HB-co-4HB)薄膜加载曲安奈德，来研究药物释放特征(图4B-b3)。虽然药物释放随时间的延长呈下降趋势，但在9个月结束时仍能检测到药物的释放，且释药量可达到3T3细胞的抑制浓度(图4B-b4)。X光下可视化是支架的一个重要特性，可以保证支架的精准置入和支架位置的持续监测。但是，P(3HB-co-4HB)自身在X光下显影较差。为了增加支架的X光下显影性能，作者利用临床上常用的油性造影剂罂粟乙碘油（EPSO），构建了5个浓度(0%、1%、3%、5%、10%)的管状支架。随着罂粟乙碘油含量的增加，支架的显影效果逐渐增强(图5H)，加入1%以上浓度的罂粟乙碘油均能获得较好的显影效果。但是，支架的拉伸强度、断裂伸长率和支撑力与碘浓度成反比(图5I)。因此，作者选择1%的罂粟乙碘油作为支架的负载浓度。
作者探究了P(3HB-co-4HB)的降解特性（图5G-g1）。将P(3HB-co-4HB)膜片置入PBS和HCl溶液，在3月和6月时测得两种溶液的pH值与初始相比无明显变化（图5G-g3），由此可以推测，P(3HB-co-4HB)降解过程对局部溶液pH值影响很小。此外，加入PEG后的P(3HB-co-4HB)降解速率比单纯的P(3HB-co-4HB)要快（图5G-g2）。在相同条件下，P(3HB-co-4HB)在胆汁中的降解速率比在PBS和HCl溶液中快（图5G-g2）。图5. P(3HB-co-4HB)的载药、可视化及降解性能
本研究中，支架被设计为中间主体螺旋结构和两端带侧翼的管状结构（图6A,7C），可以有效防止支架发生移位。作者在螺旋结构的外表面增加了轨道凹槽设计可以使支架实现内外双重引流的功能（图6A，7C）。作者探究了不同螺距、直径及厚度对支架力学性能的影响（图6B,C），可以发现外径2.8mm、厚度0.4mm的P(3HB-co-4HB)支架可以达到和临床用塑料支架相似的力学性能（图6D,E）。纵向循环拉伸试验表明，支架在50%应变时具有良好形变恢复能力（图6F）。正常的胆汁在体外静置后会逐渐形成胆泥，所以构建的支架是否容易粘附胆泥是支架的一个重要特性。随着时间的推移，构建的P(3HB-co-4HB)支架的质量逐渐减少，而塑料支架由于胆泥的附着，其质量呈上升趋势（图6G），表明P(3HB-co-4HB)支架具有胆泥自清洁作用。螺旋支架在丙酮中表现出良好的形状记忆效应(图6H)，当支架在丙酮中浸泡时，支架逐渐展开至条状，当支架被取出后支架逐渐恢复至原有管状形态。当支架悬浮在含有丙酮的锥形瓶中时，观察到类似的形状记忆效应(图6I)。 支架的自扩张可以有效扩大引流腔直径，有助于增强引流效果，作者探究了不同溶剂和温度条件下P(3HB-co-4HB)螺旋支架的自扩张效果（图6J,K）。在四种溶剂中，支架在丙酮中的自扩张作用最明显，在酒精中膨胀效果次于丙酮，在PBS和胆汁中的扩张作用相似，但弱于酒精（图6K）。体温比室温条件下更有助于增强支架的自扩张效果（图6K）。
图6. 支架的构建及性能研究
作者通过内镜下热损伤，在2头迷你小香猪体内建立良性胆管狭窄模型(图7A,B)，通过胆红素变化和胆管镜直视下观察证实了胆管狭窄造模成功（图7B,G）。ERCP下成功将一外径2.8mm、长11.5cm的载药胆管支架置入实验组狭窄胆管内(图7C, D)。另外一头小香猪用于组织学对照研究，未行支架置入治疗。于术后0天、3天、1周、2周、4周、8周行X线观察实验组支架位置及扩张情况, X线下支架轮廓清晰且位置正常(图7E,X-ray)。支架的主体螺旋结构逐渐扩张，扩张速度在1周时逐渐趋于稳定，在8周时扩张至5.3mm(图7F)。置入支架后第3天，实验组观察到猪巩膜由明显发黄逐渐变回白色(图7E,selera)，之后巩膜黄染未再出现。血清学结果显示，造模20天时，血液检测显示肝功指标和WBC明显升高(图7G)，经过该支架治疗，总胆红素与直接胆红素在支架置入后第3天开始明显下降，此后逐渐降至正常，在置入支架后2周，WBC、ALT及AST等指标也明显下降(图7G)，说明该可降解支架能够有效解除胆管梗阻、改善肝功能和控制炎症。
图7. 胆管狭窄模型构建、支架置入及疗效评价
8周后，内镜下观察，可见支架位置正常(图8A)。对实验动物实施安乐死，解剖进入腹腔后可以看到支架在胆管内的轮廓，胆总管外壁光滑，无穿孔、溃疡等(图8B)。解剖取出胆总管，可见支架位置正常、胆管通畅 (图8B)。取部分胆管支架放入烘箱烘干，将烘干后的支架(图8C-c3)与烘干前的支架(图8C-c2)以及置入前的初始支架(图8C-c1)进行比较，可见扩张后的支架在烘干后直径由5.3mm恢复至3.6mm。H&E染色未观察到溃疡、穿孔或组织坏死(图8D)。显微镜下观察，可见对照组胆管壁显著增厚，最厚达3.2mm，管腔出现明显狭窄，黏膜层组织已被破坏，局部出现大量炎症细胞浸润和大量胶原纤维沉积，纤维排列紊乱，密集处可呈结节状。α-SMA阳性区域比例明显增高，提示管壁存在大量的肌成纤维细胞，PCNA染色同样提示胆管壁组织处于明显的增生状态(图8D model group)。与对照组相比，实验组在经过支架治疗后管腔狭窄显著缓解（4.27mm vs 2.29mm）（图8E）。与对照组相比，实验组胆管可见新生的黏膜层组织(图8D TA-stent group)，肌成纤维细胞的比例（11.1% vs 21.3%）以及组织增生的程度（4.7% vs 14.1%）均得到了很好的改善（图8E）。以上结果表明，该载药支架一方面通过机械支撑使狭窄胆管通畅；另一方面，通过局部缓释曲安奈德，达到抑制成纤维细胞增殖的作用。
图8. 胆管狭窄模型猪胆管解剖后支架大体和显微镜观察及组织学染色
本研究利用天然细菌——钩虫贪铜菌，通过调节培养底物的种类和浓度，制备出具有力学性能和理化性能可控的P(3HB-co-4HB)。利用P(3HB-co-4HB)构建了具有形状记忆功能及弹性可控的多功能胆管可降解支架，通过细胞实验和动物实验证实了材料和支架的良好生物相容性。该支架一方面，通过主螺旋结构的机械支撑作用，使狭窄部位得到有效缓解；另一方面，通过局部缓释曲安奈德，从而抑制成纤维细胞增殖，达到降低再狭窄发生率的治疗效果。该支架实现了胆管狭窄局部力学支撑和药物治疗的双重作用，为未来胆管良性狭窄的内镜下治疗提供了可靠的实验依据。
原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.202303779
陆军军医大学新桥医院消化内科王伟硕士、栾兆辉博士、舒贞贞硕士为本文共同第一作者，陆军军医大学新桥医院消化内科樊超强教授、杨仕明主任、赵晓晏教授和加拿大曼尼托巴大学邢孟秋院士为本文共同通讯作者。该项目获得国家自然科学基金（No.82270700）和重庆市科卫联合医学科研项目 (No.2023GGXM004)的大力支持。
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