撰稿︱刘毅明审稿︱胡长江，杨仕明 责编︱王思珍，方以一胃癌发病率高、死亡率高，分子机制尚未完全阐明。叉头盒蛋白M1(FOXM1)是叉头盒家族的成员之一，具有特征性的翼状螺旋DNA结合结构域，在胃癌的发生和进展中发挥着重要作用。然而包括 FOXM1在内的转录因子，通常被认为“不可成药”。
近期，陆军军医大学新桥医院消化内科胡长江副教授、杨仕明主任团队，在JCI insight上发表题为“RNF112-mediated FOXM1 ubiquitination suppresses the proliferation and invasion of gastric cancer”的研究。该研究发现RNF112是靶向FOXM1降解的新E3泛素连接酶，进一步证实RNF112靶向FOXM1泛素化降解发挥抗肿瘤作用。此外还发现小分子化合物RCM-1显著增强 RNF112和FOXM1之间的相互作用导致FOXM1降解。总之上述研究表明RNF112具有靶向FOXM1泛素化降解的能力，RNF112-FOXM1信号有望成为胃癌的潜在诊断标志和新的治疗靶点。1.筛选靶向FOXM1的E3泛素连接酶的工作流程图
将靶向E3泛素连接酶的siRNA文库筛选，发现敲低其中34种 E3 泛素连接酶导致FOXM1蛋白表达上调超过1.5倍。结合E3泛素连接酶预测工具 UbiBrowser (http://ubibrowser.ncpsb.org.cn/ubibrowser/)、UbiNet 2.0 (http://awi.cuhk.edu.cn/~ubinet/ index.php)、蛋白表达分析工具GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/)、UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/)，提示77种E3泛素连接酶可靶向降解胃癌中FOXM1。上述结果取交集后发现有9种E3连接酶，进一步验证发现RNF112是降解FOXM1的泛素化连接酶。图1. 鉴定靶向 FOXM1 降解的新型 E3泛素连接酶的工作流程图
2.筛选并验证靶向FOXM1的E3泛素连接酶
采用ONTARGET plus E3连接酶的siRNA文库转染293T细胞48小时，内源性FOXM1升高超过1.5倍的有34个(图2A);随后，使用E3泛素连接酶预测工具 UbiBrowser (http://ubibrowser.ncpsb.org.cn/ubibrowser/)和UbiNet 2.0 (http://awi.cuhk.edu.cn/~ubinet/ index.php)，结合蛋白表达分析工具GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/)和UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/)进行分析，结果提示有77种E3泛素连接酶可能靶向降解胃癌中的FOXM1。上述结果取交集后得到有9种E3连接酶。其中RNF112对FOXM1表达的抑制作用最强（图2B）。分析GES-1、MKN28、MKN45、MGC803、BGC823细胞中内源性FOXM1和RNF112的表达情况，发现FOXM1与RNF112呈显著负相关（图2C）。RNF112显著抑制FOXM1表达及其蛋白稳定性（图2D-E），蛋白酶体抑制剂MG132显著逆转了RNF112抑制的FOXM1表达（图2F）。敲除内源性RNF112显著上调了 FOXM1 的表达水平，提高了FOXM1的蛋白稳定性（图2G-H）。3. RNF112在体外下调FOXM1从而抑制胃癌细胞的生物学行为
RNF112过表达显著抑制胃癌细胞中FOXM1下游基因转录活性（图3A）、下游靶基因（CKS1、CCNB1、SKP2、FN1、ZEB1）的mRNA（图3B-C）、蛋白表达（图3D）、胃癌细胞增殖和侵袭转移能力（图3E-F）；而敲除RNF112明显上调胃癌细胞FOXM1下游基因的转录活性（图3G）、下游靶基因mRNA 表达(图3H)、蛋白表达（图3I）、胃癌细胞增殖和侵袭转移能力（图3J-K）。图3.RNF112在体外下调FOXM1从而抑制胃癌细胞的生物学行为4. RNF112 在体内抑制胃癌细胞的增殖及侵袭转移
使用RNF112稳定过表达的MGC803细胞构建了裸鼠皮下移植瘤模型。结果发现，RNF112在体内显著抑制了胃癌细胞的生长和重量(图4A-C）、FOXM1及下游靶基因的表达(图4D-E）、增殖标志物 Ki67及PCNA表达（图4F）；裸鼠尾静脉注射RNF112稳定过表达的MGC803细胞，构建了胃癌肺转移瘤模型。通过小动物活体成像系统观察小鼠肺部肿瘤转移情况，并通过HE染色计算肺部肿瘤的大小，结果显示RNF112显著抑制胃癌细胞在小鼠肺部的转移(图4G-H)。图4. RNF112 在体内抑制胃癌细胞的增殖及侵袭转移5. RNF112与FOXM1存在相互作用从而导致FOXM1的泛素化降解
免疫共沉淀和GST-pull down 证实 RNF112 与FOXM1存在蛋白-蛋白相互作用（图5A-B），免疫荧光染色显示RNF112与FOXM1存在共定位（图5C）。设计了截短突变实验，构建了RNF112-N、RNF112-GBP、RNF112-C 三种截短突变体（图5D）,又设计了FOXM1-ΔN、FOXM1-ΔDBD、FOXM1-ΔC三种截短突变体（图5E）。免疫共沉淀结果显示，RNF112的N端（1-147 aa）与FOXM1的DBD端（235-347 aa）存在相互作用（图5F-G）。体外泛素化实验证实RNF112过表达显著上调FOXM1的泛素化水平(图5H)。图5. RNF112与FOXM1存在相互作用从而导致FOXM1的泛素化降解6. RNF112对FOXM1表达及胃癌细胞恶性行为的调控依赖其酶活性
将RNF112环指结构域上C3HC4序列内的5个关键半胱氨酸或组氨酸点突变为丙氨酸（C57A、C72A、C74A、C77A、C80A），从而构建了无催化活性的RNF112突变体RNF112-Mut（图6A）。在 HEK293T 细胞中分别转染RNF112及RNF112-Mut质粒后，免疫共沉淀实验、体外泛素化实验结果显示，RNF112的酶活性位点突变不影响其与 FOXM1的相互作用（图6-B），但RNF112-Mut不再导致FOXM1的泛素化降解（图6C）。在MGC803及BGC823细胞中过表达RNF112及RNF112-Mut，结果发现 RNF112-Mut不再抑制FOXM1及其下游靶基因的表达（图6E-F）。RNF112-Mut不再能抑制胃癌细胞的增殖和侵袭转移（图6G-H）。以上结果表明，RNF112对FOXM1 表达及胃癌细胞恶性行为的调控是依赖其E3泛素连接酶活性。图6. RNF112对FOXM1表达及胃癌细胞恶性行为的调控依赖其酶活性7.小分子化合物 RCM-1增强FOXM1与RNF112 的相互作用
RCM-1显著增强细胞质内FOXM1的分布(图7A)，并增加了RNF112与FOXM1的相互作用(图7B)。RCM-1明显促进FOXM1泛素化修饰、抑制FOXM1下游靶基因表达(图7C-D)。出核抑制剂LMB减轻RCM-1介导的RNF112-FOXM1互作，明显逆转了RCM-1抑制的FOXM1表达(图7E-F)。分子对接和分子动力学模拟显示，在FOXM1和RNF112互作界面的关键氨基酸残基之间形成了三个盐桥Asp 321-Arg 98（~2.9 Å，~2.7 Å）、Asp 261-Arg 85（~2.8 Å）和一个氢键His 269-Glu 90（~3.4 Å）（图7G）。图7H显示了关键氨基酸残基之间的结合自由能。RCM-1加入到FOXM1/RNF112复合体中后，在FOXM1与RNF112的不同关键氨基酸残基之间形成了3个盐桥：Asp 321-Lys 17（~1.7 Å）、Asp 321-Arg 20（~2.8 Å）、Asp 261-Arg 85（~3.2 Å），及7个氢键：Asp 321-Lys 17（~2.8 Å）、Asp 321-Arg 98（~2.8 Å），His 269-Glu 90（~3.0 Å）、Asp 268-Arg 133（~3.8 Å），Glu 235-Glu 19（~3.9 Å）、Ser 232-Glu 19（~2.9 Å，~3.0 Å），这些分子间作用力有效地促进了FOXM1与RNF112间的潜在亲和力（图7I）。在加入RCM-1之后，FOXM1与RNF112关键氨基酸之间的结合自由能减少，并且还鉴定出了两对额外的关键氨基酸（图7J）。以上结果表明RCM-1促进FOXM1与RNF112间形成额外的分子间作用力，减弱FOXM1与RNF112关键氨基酸残基间的结合自由能，从而促进FOXM1与RNF112的结合。图7. 小分子化合物 RCM-1增强FOXM1与RNF112 的相互作用8. RCM-1对胃癌细胞增殖能力的抑制作用依赖于RNF112
在RNF112敲除的MGC803细胞中，RCM-1对FOXM1的抑制程度显著减弱（图8A）；RNF112敲除明显缓解了RCM-1对胃癌细胞增殖能力的抑制（图8B）。裸鼠皮下接种野生型和RNF112敲除的MGC803细胞后使用RCM-1治疗，结果显示，RCM-1在体内能够明显发挥抗肿瘤作用，而对于RNF112敲除的胃癌细胞，RCM-1的抑癌作用相对较弱（图8C-E）。RCM-1可明显抑制野生型胃癌细胞FOXM1、Ki-67和PCNA的表达，但对敲除了RNF112的胃癌细胞影响有限（图8 F）。图8. RCM-1对胃癌细胞增殖能力的抑制作用依赖于RNF1129.胃癌组织中FOXM1与RNF112呈负相关
多色荧光免疫染色检测了110例人胃癌及邻近非肿瘤组织中FOXM1及RNF112的蛋白表达水平，发现FOXM1在肿瘤组织中表达较高，而RNF112表达较低（图9A）。FOXM1在高TNM分期的胃癌组织中高表达，而RNF112在其中低表达（图9B-C）。ROC 曲线表明，基于 FOXM1 和 RNF112 表达，预测生存曲线下的面积（Area Under the Curve，AUC）分别为 0.7536 和 0.7186，这表明它们均是用于预测患者生存时间的候选标志物（图9D-E）。图9F-G显示，高FOXM1表达或低RNF112 表达均是胃癌患者预后不良的标志。依据FOXM1与RNF112的表达将胃癌患者分为四组后发现，FOXM1高表达且RNF112低表达患者的生存预后最差(图9H), FOXM1与RNF112在胃癌组织中呈显著负相关(图9I)。该研究通过基于ON-TARGET plus siRNA文库筛选的方法，鉴定了在胃癌中靶向FOXM1泛素化降解的E3泛素连接酶 RNF112。还发现RNF112通过靶向降解FOXM1发挥抑癌作用。在胃癌组织中，RNF112明显低表达，并与FOXM1呈负相关。小分子化合RCM-1通过促进 RNF112和FOXM1相互作用，并增强RNF112对FOXM1的泛素化降解，抑制肿瘤的生长，总之该研究为靶向RNF112-FOXM1的抗胃癌策略提供了重要新思路。
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37288663/作者介绍：
陆军军医大学新桥医院消化内科张晟玮博士、王静硕士为本文共同第一作者，陆军军医大学新桥医院消化内科胡长江副教授、杨仕明主任为本文共同通讯作者。研究获得国家重点研发计划项目(2018YFA0507900)和国家自然科学基金(81773141)等资助。
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