CMBL 综述︱于波团队评述CRISPR技术在肿瘤领域的作用及研究进展

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撰文︱于波团队

责编︱王思珍，方以一

肿瘤长期以来一直是全球主要的公共卫生问题，并且是全球第二大死因。尽管传统疗法（如化疗、放疗和手术）一直是肿瘤治疗的支柱，但它们存在一些局限性，包括低特异性、副作用以及缺乏预防肿瘤进展或复发的能力。因此，开发提高治疗精确性、效果和耐受性的策略变得尤为紧迫。其中一个重要的进展是基因治疗，通过操纵遗传物质来修复致癌基因突变。随着我们对基因组学的深入了解，像CRISPR这样的基因编辑技术正展现出在肿瘤精准治疗中的巨大潜力。

成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白Cas9最初被认为是细菌和古细菌的自身免疫系统，后来发现其具有靶向编辑双链DNA的功能，这极大地推动了生命医学研究的进展。多年来，研究人员尝试各种改进方法以提高其特异性和效率，并在临床试验中取得了极具前景的初步结果。较新发现的Cas12和Cas13系统也显示出在基因治疗和分子诊断方面的潜力。

2023年9月6日，北京大学深圳医院于波教授课题组在Cellular & Molecular Biology Letters上发表了题为“CRISPR applications in cancer diagnosis and treatment”的综述报告。作者系统地评述了Cas9、Cas12和Cas13的结构功能特点，评估了CRISPR系统在肿瘤基因治疗和分子诊断方面的最新进展和应用，强调了理解每种CRISPR系统的优势和限制的重要性，从而帮助科研人员最大限度地发挥其临床应用价值。

一、应用广泛的Cas相关蛋白结构

CRISPR-Cas家族主要包含两个大类别。其中第二大类约占10%，由于该系统由单一、多结构域的蛋白组分构成且易于操作，所以其应用更为广泛且频繁。第二大类CRISPR-Cas系统又可细分为II型、V型和VI型三种类型。其中，以Cas9为代表的II型系统是最广为人知并被深入研究的，该系统可对双链DNA进行切割。以Cas12为代表的V型系统也针对DNA，而以Cas13为代表的VI型系统结构上有所不同，其靶标是单链RNA（ssRNA）。

图1 Cas蛋白质域组织的示意图以及Cas蛋白质-sgRNA-靶序列复合物的晶体结构

二、CRISPR-Cas9在肿瘤中的应用进展

CRISPR-Cas9被发现后，目前已有较多研究探索其在各个领域的应用。在癌症领域，相关研究方向主要包括疾病模型构建、全基因筛选平台构建及基因疗法。CRISPR-Cas9系统可作为一种简单且有效的方法应用于癌症和遗传性疾病等疾病模型的构建，使得我们对疾病病理的理解更为深入。除此之外，CRISPR-Cas9系统可应用于癌细胞功能基因筛选和表观遗传调控研究，通过该方法发现一些肿瘤生物学特性，包括肿瘤生长，转移，治疗抵抗和对免疫疗法的反应等方面的病理机制。癌症治疗方面，CRISPR-Cas9介导编辑的CAR-T细胞展现巨大的治疗潜力，当前有许多基于CRISPR-Cas9的治疗方法正处于临床试验阶段，已有部分研究报道了积极的结果，这些CRISPR-Cas9的临床试验为未来基因疗法的广泛临床应用打下了坚实的基础。

另外，CRISPR-Cas9进一步被改造，更新迭代，Base editor及Prime editor克服了传统CRISPR-Cas9靶点位置的限制及非预期靶点外编辑等缺点。与癌症相关的应用方面，目前这两种新型的基因编辑工具与Cas9类似，主要在癌症基因功能筛选、癌症模型构建、CAR-T细胞构建等方面展示巨大的转化潜力。

图2 基于CRISPR-Cas9的分子工具实现基因灵活调控

三、CRISPR-Cas12及CRISPR-Cas13在肿瘤中的应用进展

除了Cas9，在基因治疗和分子诊断领域，Cas12及Cas13也备受关注。与成熟的Cas9系统相比，Cas12a的编辑效率略有降低，但特异性更高。同时，Dead Cas12a的发展揭示了其调控靶基因表达的潜力超过了dCas9系统。Cas12a系统的另一个重要特点是它能够自主处理crRNA，这有助于同时调控多个靶点。通过干扰常见的致癌基因，一些研究已经尝试在癌症治疗中应用Cas12a。除此之外，Cas12a也作为分子诊断的新型工具被广泛应用，并且在检测特定目标时表现出极高的灵敏度。与液滴数字聚合酶链式反应（ddPCR）相比，它不仅灵敏度更高，而且检测速度更快。正在进行的临床试验主要集中在遗传病或感染病。随着更多临床数据的积累，我们将能够更好地评估Cas12a在临床应用中的有效性、安全性和可行性。

Cas13是一种靶向RNA的CRISPR蛋白，虽然也在基因治疗和分子诊断领域得到应用，但其作用原理与前两者有显著不同。过往研究发现，Cas13主要通过转录后修饰来调控靶基因表达，然而目前尚没有相关的临床研究。在分子诊断方面，Cas13a的性能与Cas12a非常相似，具有高灵敏度、特异性和短检测时间的优势。正在进行的科研项目主要集中在肿瘤和传染病方面。与传统基于PCR的检测方法相比，CRISPR检测具有低成本、低人力和高效率等优势，在与高通量测序技术结合使用后，具有进行大规模高通量检测的巨大潜力。

图3 CRISPR-Cas12a及CRISPR-Cas13a功能示意图。

图4 CRISPR技术在肿瘤领域中的广泛应用

四、总结与展望

综上所述，该研究全面总结了CRISPR系统在肿瘤基因治疗和分子诊断领域的研究进展，旨在激发在这一迅速发展领域中的进一步探索和创新。文章重点介绍了Cas9、Cas12和Cas13在药物/靶点筛选平台、疾病模型构建、体外分子诊断和基因治疗四个方面的最新应用进展，同时提出了一些工具的局限性和现有迭代工具的挑战。总的来说，CRISPR技术的发展为肿瘤机制研究、早期筛查、精准医疗提供了新的希望。

第一作者：汪明霞博士（左一）、陈梦晖硕士（左二）、通讯作者：黄新波博士（右二）、于波教授（右一）

汪明霞博士、陈梦晖硕士为该论文共同第一作者，黄新波博士和于波教授为共同通讯作者。本研究获得了深圳市重点学科建设基金和深圳市三名工程项目支持。

通讯作者简介：

黄新波，北京大学博士，皮肤科临床医师。主要研究方向为皮肤病学、肿瘤精准治疗及合成生物学。以第一或通讯作者于Molecular Therapy、Theranostics、Cellular & Molecular Biology Letters等学术期刊发表SCI论文10余篇。

于波，北京大学医学部教授、博士生导师，深圳市地方级领军人才。在Br J Dermatol, Arthritis & Rheumatism, Contact Dermatitis等期刊发表SCI论文30余篇，副主编专著《实用儿童皮肤病学》，副主译专著《Bolognia Dermatology》4nd Editioon，参编《皮肤性病科临床实践-导引与图解》（国家规划教材）、《皮肤病与性病图谱》（国家规划教材）、《皮肤美容激光治疗原理与技术》等专业论著。获深圳市科技进步奖二等奖一项。主持国家自然科学基金面上项目2项和省厅级科研项目12项。

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