Nat Commun︱杨照罡/滕乐生团队设计特异性装载mRNA的细胞外囊泡

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撰文︱崔雅欣，张欢

审阅︱杨照罡

责编︱王思珍

近年来，尽管mRNA在各种临床应用中已经取得了良好的治疗效果[1]。但是，传统的mRNA递送系统在克服生理障碍实现组织和细胞靶向递送等方面仍然存在一定的困难。细胞外囊泡（EVs）较其他mRNA递送载体具有生物安全性高、生物相容性好以及能够跨越生理屏障等优势[2-5]。基于上述优势，EVs成功用于递送治疗癌症的mRNA已有报道[6-7]，但它们用于携带特异性以期实现选择性恢复肿瘤免疫原性并提高肿瘤免疫治疗效果的有效性评估尚未被探讨。

2023年10月19日，吉林大学生命科学学院杨照罡教授、滕乐生教授，MD安德森癌症中心团队（姜闻教授、Betty Kim教授）以及路易斯安那理工大学王盛年教授课题组通力合作，在Nature Communications上发表题为“Adaptive design of mRNA-loaded extracellular vesicles for targeted immunotherapy of cancer”的研究成果。该研究发明了一种全新的微流控电穿孔系统，运用两步脉冲刺激方法（nsEP）大量产生表面过表达CD64蛋白的EVs，并在自身内部主动招募IFN-γ mRNA实现聚集。这种EVs通过实现特异性mRNA负载、肿瘤靶向和微环境调控的多种策略，显著提高了癌症免疫治疗效果（图1）。该研究提供的特异性装载mRNA的细胞外囊泡方法，为其在癌症免疫治疗中的应用奠定了基础。

图1. 免疫EVs的大规模生产和治疗机制示意图。

为了揭示nsEP触发sEV释放的细胞机制，此研究采用蛋白质组学分析方法得出结论为，在nsEP刺激过程中，sEV分泌的增加强烈依赖于MLKL（图2a-e）。通过沉默/过表达MEF细胞中MLKL，进一步表明MLKL在这一过程中参与了EVs分泌的调节（图2f和g）。

图2. 经nsEP 处理的MEF细胞的蛋白质组学分析。

为了研究imsEV在体内的免疫治疗潜力，该研究静脉注射sEV到植入GL261肿瘤的免疫活性小鼠中。体内成像系统（IVIS）的结果显示，与非靶向sEV相比，肿瘤内imsEV的积累显著增加，而肝脏的积累也相应减少（图3b和c）。每3天给GL261荷瘤小鼠注射imsEV，可在肿瘤植入后7天显著抑制肿瘤生长（图3d和e），并延长生存期。经imsEV处理的小鼠的中位生存时间为53天，而经抗体组合处理的小鼠为35天，对照组为29天（图3f）。对残余肿瘤组织的免疫分析显示，imsEV治疗后IFN-γ蛋白表达增加（图3g）。与其他处理条件相比，imsEV处理后的MHC-I水平也有所上调（图3h）。在恢复MHC-I表达GBM中，CD8+细胞的比例在肿瘤组织imsEV治疗小鼠也增加（图3i，j），和IFN-γ的上调与m1型巨噬细胞的比例增加在肿瘤部位（图3k）。组织学染色进一步显示，imsEV治疗大大降低了GBM组织中肿瘤细胞的增殖。同时，没有观察到对心、肝、脾、肺、肾等主要器官的毒性作用。

图3 imsEV在原位GL261胶质瘤模型中的体内治疗效果。

该研究在验证了imsEV在中度免疫原性GL261小鼠模型中的治疗潜力后，继续研究其在原位SB28小鼠GBM模型中的抗肿瘤作用，该模型由于其内在MHC-I表达较低，免疫原性较差，在表型上与人类GBM相似。实验结果与GL261模型相似，从imsEV处理组在2和4小时的强DiR荧光可知，imsEV在SB28肿瘤中的积累程度高于非靶向sEV（图4a）。体外数据进一步证实，相对于非靶向sEV，在肿瘤中积累的imsEV更多，而在肝脏中积累的更少（图4b和c）。在imsEV治疗后，肿瘤生长也显著减少（图4d和e），生存时间也有所延长（imsEV治疗组的中位生存时间为50天，而PBS治疗组为27天）（图4f）。磁共振成像进一步证实，与其他治疗组相比，imsEV治疗组的动物肿瘤最小（图4g和h）。在imsEV治疗后，肿瘤中IFN-γ和MHC-I的表达增加(图4i，j）。

图4 imsEV对原位SB28胶质瘤模型的体内治疗效果。

文章结论与讨论，启发与展望

该研究报道的一种具有微流控配置的nsEP系统能够生成大量封装mRNA的sEV，同时验证了imsEV成功地结合了抗CD71和抗PD-L1。imsEV在GBM细胞中具有靶向作用，并递送IFN-γ mRNA和PD-L1抗体，可以将肿瘤的免疫微环境从免疫抑制表型转变为免疫刺激表型。总的来说，该研究结果表明，一种有效特异性装载mRNA的sEV的设计策略，可以为其在癌症免疫治疗中的应用奠定基础，为提高免疫耐药肿瘤的反应性开辟新的道路。然而，目前还没有明确的证据证明修饰后的sEV货物是否在人类受体中具有较低的免疫原性活性。在人类临床中应用改进的sEV之前，严格的临床前研究和遵守监管指南是非常必要的。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-42365-5

该论文第一完成单位为吉林大学生命科学学院，生命科学学院的博士研究生董是言（现为MD安德森癌症中心博士后）为第一作者，吉林大学杨照罡教授、滕乐生教授，MD安德森癌症中心团队（姜闻教授、Betty Kim教授）和路易斯安那理工大学王盛年教授为论文的共同通讯作者。该研究工作得到了国家自然科学基金海外优青、吉林省科技厅、美国国家卫生研究院、美国路易斯安娜州政府等项目的资助。

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本文完