干货分享 | 基因毒性杂质的法规、来源、检测、控制（第三期）
卤代烷烃的致突变性机理、来源、检测方法与案例分析（下）
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卤代烷烃广泛用于制药工艺中。许多卤代烷烃都经过了致癌和致突变活性测试。
第二期我们介绍了卤代烷烃的致突变性机理、来源，本期内容主要介绍卤代烷烃的检测方法与案例分析。
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检测方法
在对卤代烷烃进行检测时，首先确定其是否具有挥发性，并依据其分子是否具有紫外吸收等的结构特点，选择合适的方法。对低沸点的卤代烷烃可采用GC、GC-MS进行分析，而对于高沸点的卤代烷烃则可采用LC、LC-MS等方法进行分析。
1.1 直接分析
采用顶空进样法对卤代烷烃进行检测，可以有效的降低基质干扰，是检测卤代烷烃的首选方法。
● Ellison等报告里利用顶空分析法（HS-GC-EDC），对多种卤代烷烃和卤代芳烃进行检测。
● Ho等则采用离子液体作为溶剂，替代常规的DMSO等溶剂，对多种高沸点卤代烷烃进行检测，扩大了HS-GC方法的使用范围。
1.2 衍生化
采用衍生化法，可以改善样品的挥发性、极性和热稳定性等，从而提高样品的分离、检测效果。
● Bai等以二甲胺溶液作为衍生化试剂，采用LC-MS-ESI法对多种卤代烷烃进行分析。氨基化衍生处理，大大改善了这些物质在质谱分析中的电离效率很低的问题。
● Ji等采用1-(4-硝基苯基)哌嗪（4-NPP）作为衍生化试剂，对卤化苄进行衍生化，解决了其基质干扰和衍生效率低的问题。
● Wijk等则采用4-二甲基氨基吡啶、1-（4-吡啶基）哌啶-4-羧酸丁酯作为衍生化试剂，采用HILIC-MS/MS对卤代烷烃进行检测。
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2
案例分析
本案例以β-内酰胺合成中使用的氯代物为例，对LC-MS、GC、GC-MS等各种分析方法进行对比优化，最终开发出合适的方法。
上图中β-内酰胺API合成过程中使用到了CCMTHP作为试剂，其为潜在基因毒性杂质，因此，需开发一种高灵敏度的方法对该杂质进行分析评估。
2.1 LC-MS
由于该物质没有紫外，因此，采用LC-MS-ESI+对其进行分析，采用SIM （m/z = 85）（四氢呋喃片段）定量，其灵敏度在30µg/mL，对应于在API中的浓度为5mg/mL。
进一步，通过改变离子化技术，如APCI，并不能提高灵敏度。
2.2 GC-FID
该物质沸点为293℃，顶空分析法并不适用，因此，采用直接进样法。API在FID下没有响应，表明该非挥发性的原料药要么已经分解，要么沉积在柱子上，因此API对分析无干扰。CCMTHP的检测灵敏度为3µg/mL，是LC-MS的10倍。FID的响应与CH2基团的数目成比例，它对完全氧化的碳，如羰基和羧基没有响应，O、S、卤素等杂原子的存在也会降低响应，因此，虽然CCMTHP有7个碳，但有效碳原子数（ECN）低于3个，这也是其低于预期灵敏度的原因。
2.3 GC-ECD
ECD通常对具有强电子吸收功能的化合物非常敏感，例如卤代物和硝基芳烃，而对碳氢化合物、醇、酮等几乎不敏感。然而，对CCMTHP的研究发现，其灵敏度为4µg/mL，与FID模式下相当。低于预期的灵敏度可能是因为CCMTHP是一种一氯化合物，其ECD响应因子与酮类似。ECD对二氯酚和三氯酚化合物的反应更灵敏，可能达到10-100倍的灵敏度。
2.4 GC-MS
● TIC模式
典型的GC-MS-TIC图和质谱图如下图所示。该方法灵敏度为5 µg/mL，相当于在API的浓度为5 mg/mL。
● SIM模式
为进一步提高灵敏度，采用SIM模式(m/z = 49, 55, 69, 84)进行分析，50 ng/mL的浓度下，S/N＞10，SIM模式较TIC模式灵敏度提高了100倍。
● SIM模式优化
然而采用该模式对API进行分析时，却发现了严重的基质干扰，与仅使用CCMTHP标准获得的结果相比，观察到的噪声水平要高得多。并且CCMTHP峰似乎与另一种降解产物重合，妨碍了CCMTHP峰在API中的准确定量。该物质质谱与CCMTHP的质谱相似，在m/z=55和84时表现出强烈的质量离子响应，而在m/z=69时则表现出较弱的响应。因此，最终决定，在API中CCMTHP的测定期间，仅使用SIM（m/z=49）监测含有氯原子的离子。
SIM (m/z = 49, 55, 69 and 84)的图谱
SIM (m/z = 49)的图谱
● 方法学验证
最终对GC-MS-SIM(m/z = 49)的方法学验证如下：
● 参考文献
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[2] Genotoxic Impurities in Pharmaceutical Manufacturing: Sources, Regulations, and Mitigation， DOI: 10.1021/cr300095f
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[10] A new HPLC-UV derivatization approach for the determination of potential genotoxic benzyl halides in drug substances, RSC Adv., 2019, 9, 25797
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斯坦德科创研究经验
斯坦德科创对各种原料药和制剂中卤代烷烃的检测，已经有相当丰富的经验，根据样品性质进行直接进样、顶空进样或者衍生化处理，采用GC、GC-MS、HPLC、LC-MS等多种方法进行方法学开发和验证。
生物医药是斯坦德集团的核心领域之一，业务涵盖药物研发CRO服务、药学研究、相容性研究、密封性研究、药物标准检测服务、生物制品研发测试服务、生物安全研发测试服务等领域。我们致力于为客户提供研发、分析及检测一站式服务，可有效助力企业缩短研发周期，让药品与医疗器械更快更安全的上市。
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