基于LC-MS技术的mRNA 加帽率、Poly A尾分析
mRNA是由DNA的一条链作为模板转录而来、携带遗传信息指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。1961 年mRNA 这类生物大分子首次被发现，之后临床应用不断得以拓展，期间以mRNA 技术为核心的相关研发企业也初见端倪，如CureVac、BioNTech 和Moderna 等。2015 年后，递送技术与修饰技术的成熟推动其加速发展，而2020 年的新冠疫情使得mRNA 疫苗和药物受到全球广泛的关注，从而带动mRNA 领域的研究快速发展[1]。
图1 mRNA发展历程
mRNA整体生产工艺主要包括质粒原液生产、mRNA原液生产、mRNA制剂制备、mRNA制剂纯化、质检及储存运输，mRNA自身存在精准合成难度高、易降解、难保存等特殊性，使得mRNA药物在过程控制、工程保证、大规模制备工艺、质量控制与质量体系等多方面存在复杂挑战。2020年发布的《预防用新型冠状病毒mRNA疫苗药学研究技术指导原则》中对mRNA的质量提出了一系列的要求，加帽率和加尾长度是其中关键的2个指标。5’ Cap (5’帽) 结构与mRNA的稳定性和免疫原性密切相关，还会影响mRNA的翻译效率。3’ poly A（3’尾）可以控制mRNA的稳定性，以防降解。所以在mRNA合成修饰过程中，需要对5’加帽效率和3’ poly A尾的分布进行监控。通过LC-MS分析确定5’端帽子的性质以及测量3’ Poly A尾巴的长度对于了解产品质量、确保mRNA新型疫苗的安全性和有效性十分关键。
5’ cap端检测分析
真核生物mRNA 的5’端通常具有桥接的7-甲基鸟苷(m7G)帽子结构（Cap0）， Cap0 结构中的第一个核苷酸的2’-O位甲基化后形成Cap 1 结构 (m7GpppmN)。目前大规模加帽方法主要有两种，一步法共转录加帽及两步法酶法加帽。一步法共转录加帽方法是通过在转录过程中添加已加帽的抗逆转帽类似物在共转录过程中实现加帽操作, 两步法酶法加帽通常采用牛痘病毒加帽体系，其兼具RNA三磷酸酯酶活性、鸟苷酰基转移酶活性和鸟嘌呤甲基转移酶活性，可将7-甲基鸟嘌呤帽结构(m7Gppp)连接到RNA的5’末端(m7Gppp5’N)。
图2 mRNA的酶促加帽步骤
由于完整的mRNA 链分子量较高，利用LC-MS 难以进行精准定量，故一般采用生物素标记探针利用SA磁珠捕获mRNA 链后，实现与杂质的分离，随后加入剪切酶将mRNA 链切断，进而对5’端帽子结构在LC-MS 仪器中进行精确定量研究测定[2]。由于不同mRNA药物都具有特殊的分子序列，故探针需要定制化生产，检测方法也需要针对不同的mRNA 分子专项开发，整体检测难度较高。
图3 mRNA 5’端帽子结构LC-MS分析前处理流程图
图4 样品中uncapped 和 Cap 1 的
色谱总离子流图及质谱图
3’ poly A尾检测分析
Poly A 加尾方法主要采用两种模式：第一种是在质粒DNA 模板中添加Poly A 结构模板，在mRNA 生成过程中直接添加Poly A 结构；另一种是使用Poly A 加尾酶，其以ATP 作为底物，通过模板将腺苷一磷酸加成到RNA 分子的3’-OH 末端。3’ Poly A尾的检测方法与5’加帽效率的检测方法类似，需要通过酶切的方式获得3’端的Poly A尾短链，然后利用Oligo dT磁珠分离纯化，样品经色谱分离后再进行质谱检测分析其长度分布。在色谱分析中常使用离子对试剂三乙胺（TEA）及六氟异丙醇（HFIP）对强极性寡核苷酸进行分离，如下图所示对于样品27-mer poly A中不同数目的腺苷可实现较好分离，而对于聚合度较大的样品64-mer poly A和100-mer poly A，不同数目的腺苷分布呈现色谱共流出状态。对于色谱共流出的Poly A分布检测，可通过质谱软件解卷积获得腺苷分布[3]。
图5 样品 UV 250 nm 下的色谱图
及解卷积后的质谱图
mRNA疗法早期开发阶段的一个关键步骤是对mRNA质量属性的广泛表征，这些属性会影响生物效能。鉴于药物开发的时间线越来越短，获得更快、更高通量的分析方法变得至关重要。在mRNA产品开发和质量控制（QC）测试期间利用快速灵敏的LC-MS分析技术对mRNA 的加帽率、Poly A尾进行分析，有助于保证mRNA工艺产品的一致性、安全性和有效性。
参考文献
[1]. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nat Biotechnol. doi: 10.1038/s41587-022-01294-2.
[2]. Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS. Anal Bioanal Chem. doi 10.1007/s00216-016-9605-x.
[3]. Poly A tail length analysis of in vitro transcribed mRNA by LC-MS. Anal Bioanal Chem. doi.org/10.1007/s00216-017-0840-6.
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