小核酸药物深度研究系列（一）高速增长背后的产业化挑战及对策
小核酸药物从作用机理来看，能够直接靶向致病靶基因或RNA片段，理论上可以调节任何基因表达，因此其治疗领域更广，有望攻克尚无药物的遗传疾病和其他难治疾病。此外，小核酸药物还具有其他优势，如研发周期短、不易产生耐药性、效果持久、研发成功率较高等，被认为是继小分子药、抗体药后推动医药产业变革的第三代制药创新技术。
自2016年小核酸药物相关技术壁垒取得突破以来，资本热潮涌入小核酸药物行业，小核酸药物行业得到前所未有的快速发展。据 Evaluate和BCG预测，2026年全球寡核苷酸类药物市场规模将超150亿美元，2020年-2025 年CAGR 35%。
与此同时，关键技术已经突破和重磅品种开始出现，产业上即将进入爆发性发展时期。全球已获批上市14款小核酸药物，2021年销量超过25亿美元。
全球获批上市小核酸药物
从前期研发到迈向商业化，小核酸药物的实力已大大突显，然而在不断推进药物上市的同时，产业化挑战却是很多相关企业难以逾越的鸿沟。
一般而言，摆在小核酸药物前期合成设计过程中的三道关卡，分别是如何进行序列设计、合成与修饰、递送系统设计，来保障药物的有效性和安全性；而在生产过程中，企业也往往面临着如何进行工艺优化保障药物的质量，如何在GMP要求下进行大规模生产制造等等一系列技术瓶颈。
小核酸药物开发和产业化流程示意
一、小核酸药物成药关键技术需积累验证，生产工艺及分析质控也存在较高壁垒
Step1 : 序列设计——壁垒较低，特异性高、有潜在活性是核心因素
小核酸药物基于碱基互补配对原则识别目标mRNA，因此相比抗体和小分子药需要识别某些蛋白质复杂的空间构象，小核酸药物的设计仅需靶标mRNA 序列，不需要大规模药物筛选，目前来看药物序列设计壁垒相对较低。
小核酸药物的序列设计往往要同时考虑序列保守性、同源性、免疫原性、脱靶等因素，最终设计出特异性高、有潜在活性的优质小核酸药物。一般来说，进行序列设计的时候需要考虑合适的序列长度、核苷酸单体的含量、碱基单体的序列，如下图所示。
序列设计时需要考量的因素
Step 2 : 化学修饰——攻克小核酸药物的成药性瓶颈
一般情况下，未经修饰的小核酸药物被细胞吸收的效率较低，且容易被细胞内普遍存在的核酸酶降解，为了克服该缺点、提高成药性，需要对寡核苷酸的主链、核糖或者核碱基进行修饰。化学修饰技术可以较好地解决核酸药物的不稳定、易被清除和降解、半衰期短等问题。目前常用的修饰位点如下图，其中ASO 和 siRNA当前主要是在磷酸骨架、核糖环、3'- 和 5'- 末端进行化学修饰，提高其底物特异性和核酸酶抗性，并降低其毒性和免疫原性。
常用的修饰位点及其特性
Step 3 : 递送技术——能突破治疗有效性和安全性难题，是当前企业商业化成功的关键因素
小核酸药物尤其是RNAi药物，分子到达作用位点需要穿过胞膜作用于胞浆或核内的mRNA，递送难度大，尽管化学修饰能够解决稳定性和免疫原性的问题，但如果不能进入细胞实现胞吞，小核酸药物依然不能发挥药物作用。这一瓶颈问题一度阻滞了小核酸药物的整体产业化进程。
小核酸药物递送各环节困难及解决办法
随着技术的不断进步，递送系统成为解决众多瓶颈问题的关键办法。目前应用于小核酸药物研发的递送系统在尺寸、形状、结构、化学性质和作用机制上都不是完全相同的，主流递送系统包括：1）GalNAc配体修饰的短干扰RNA(siRNA)偶联物；2）脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles，LNPs）；3）外泌体。
当前小核酸药物采用的主流递送系统
与递送系统相关的专利突破也是影响企业商业化成功的关键因素。这是由于递送技术的开发极具挑战性，需要同时保证精准递送、维持药物活性并具有较高的安全性。但个体差异会导致在不同人体内，以及针对不同适应症时，即使是同一递送技术都可能产生不同效果。因此，企业在开发核酸药物过程中需要将递送技术真正投入到临床应用中反复进行技术积累和验证。同时，目前GalNAc与LNP递送系统已被验证，相关企业在物质组成和方法专利等方面的知识产权保护很全面，因此递送系统的突破是企业商业化成功的关键因素。
Step 4 : 生产工艺——耦合效率是合成最核心因素
1）原料药生产：以siRNA 药物生产商瑞博生物为例，其小核酸原料药的生产采用的是化学合成法。通过寡核苷酸自动合成仪，逐次将核酸单体连接至所需要的序列和长度后，通过几步脱保护反应，将寡核酸链与固相载体的连接切除并脱除各种保护，之后需要进一步通过纯化、超滤和冻干得到单链中间体。之后将得到的正义链和反义链核苷酸按比例进行退火处理，从而杂合成为双链，再进行冻干、包装，即得到 siRNA 原料药产品。
在合成过程中，核酸单体的耦合效率是最为核心的要素。耦合效率的高低可以通过序列设计等环节进行控制，也包括合成过程中的其他因素控制，比如合成环境温湿度，脱保护时间，耦合时间等也都会影响到最终的耦合效率。此外，还需要考虑的因素包括水分因素（一般是要求低于30ppm）、设备硬件（柱塞泵本身的精度和稳定性直接会对合成效果产生影响）等。
小核酸药物生产和制剂工艺
2）制剂生产：需要根据小核酸药物分子的理化性质特点来进行开发。以主流剂型无菌注射液为例，生产工艺主要包括：缓冲液和药液的配制、无菌过滤、灌装、轧盖、 包装等环节。在制剂生产需要考量的重要因素是递送系统及辅料的复杂性、均匀性、稳定性和细胞毒性，例如需要考虑脂质、聚合物纳米粒子等复杂成品中的异质性粒子，以及纳米颗粒在运输和给药时的不稳定性。
Step 5 : 分析与质控——缺乏明确指导原则，提纯难度很大
目前小核酸药物生产制备中主流的分离纯化设备包括反相HPLC和离子交换HPLC，需要根据碱基序列的特点来选择分离纯化的方式。普通的DNA、RNA或者修饰过的碱基序列一般会采用离子交换树脂，而序列3’端或者5’增加了PEG或者其他递送系统（LNP脂质纳米颗粒），往往就需要使用高压柱来进行纯化分离。
值得一提的是，目前ICH、FDA没有关于小核酸药物质量期望和标准的清晰指导原则，杂质鉴定和定量限制尚未统一。CDE在2021年6月发布了《基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（征求意见稿）》，仅提到质量研究内容应覆盖所有可能与产品安全性、有效性相关的特性，一般包括结构、鉴别、一般理化特性、纯度、生物学活性、基因转导效率、杂质、基因型、表型等。
同时，小核酸药物自身结构对于色谱分离纯化提出了更高的要求。由于其携带负电荷，小核酸药物对HPLC反相色谱C18填料纳米填料残余硅羟基封端的要求更高。但由于绝大多数杂质与小核酸药物相近且往往以混合物的形式存在，目前又缺乏精确灵敏的分析方法能够分离杂质，小核酸药物表征难度极大，其分析和质控往往存在着非常大的风险。因此，尽管有很多提高纯度的方法正在研发，纯化的种种难度导致美国上市小核酸药物的规定的药物纯度仍远远低于小分子化药。
Step 6 : 扩大生产——在各环节上存在较高壁垒，控制成本、积累能力方可制胜
小核酸原料药生产在质量控制、工艺优化上均存在较高壁垒，另外大规模核酸合成仪和纯化设备十分昂贵，造成大量合成和纯化小核酸原料药的成本高昂，大大限制了寡核苷酸药物的产业化应用。总而言之，在规模化生产中，对于小核酸药物而言，相比于化学小分子和生物药挑战更大：
1）高性价比原料的可及性：寡核苷酸和核苷单体是核酸原料药的关键物料，而近年来核酸类药物的爆发式增长对核苷单体的需求急剧增加。目前全球仅有为数不多的合格供应商，因此这对符合质量要求的核苷单体的及时供应提出巨大挑战。
2）质量控制和工艺优化：虽然固相合成工艺比较可靠，但>20的碱基正反义链寡核苷酸的总收率并不高，同时会产生大量的副产物和杂质，需要液相色谱系统分离纯化。核酸类杂质结构非常近似，分析及控制是难点，需要项目实践积累大量经验。
3）高性价比设备的可及性：生产寡核苷酸的主要设备分为合成仪、纯化仪、超滤仪和冻干机。目前纯化、超滤和冻干设备均陆续实现了国产设备替代，但寡核苷酸合成仪目前仍被Cytiva独家垄断。
4）环境和设施的要求：小核酸原料药生产设施的洁净环境须符合GMP要求，生产工厂需要有大量溶剂的回收和处理能力。
二、小核酸药物对CDMO需求巨大，国内领军企业已频频开展合作
细胞基因治疗CMO/CDMO的全球市场规模（2016-2025（估计））
国内小核酸领军企业与CDMO已频频开展合作。从近两年国内小核酸领域的合作交易事件，不难看出小核酸研发企业与各大CDMO公司纷纷各展所长，优势互补，通过合作方式快速推动我国小核酸药物领域发展，加速药物开发上市进程。
我国近两年小核酸领域的合作交易事件
小结
小核酸药物相比现有小分子和抗体药物具有一系列优点，有望从“源头”解决疾病，具有较大发展潜力。然而目前从研发到生产的核心技术还面临挑战。为了加快推动小核酸药物的发展，一方面可以期待各国药品监管部门尽快制定专门针对小核酸药物研发的指导原则，另一方面还可以通过与CDMO等专业服务公司进行合作，“让专业的人办专业的事”，共同助力国内小核酸药物的研发和产业化进程。
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