Nature Communications | 土地利用驱动的土壤pH变化影响微生物碳循环过程
土壤微生物通过平衡土壤有机质的积累和释放，成为土壤-大气碳交换的信息传递者。然而，对机制缺乏了解，阻碍了制定有效的土地管理战略来增加土壤碳储存。在这里，我们通过地理分布的土壤和土地利用对比，实证检验了微生物生理生态特征和表土碳含量之间的联系。我们发现了不同的PH对微生物碳积累机制的控制。在低PH土壤中，土地使用的强化将pH提高到阈值(~6.2)以上，通过增加分解导致碳损失，随后减缓微生物生长的酸阻滞(acid retardation)。然而，在接近中性的PH土壤中，随着土地利用强度的增加，碳的损失与微生物生物量的减少和生长效率的降低有关，而这反过来又与压力缓解和资源获取之间的权衡有关。因此，在接近中性的PH土壤中，不太密集的管理措施（较弱的土地利用程度）通过提高微生物生长效率而具有更大的碳储存潜力，而在酸性土壤中，微生物生长对分解速率（碳分解）有更大的限制。
2 研究背景：
随着人口的不断增长，对食物和能源的需求给地球的土壤资源带来了巨大的压力，而集约的土地管理往往会导致土壤有机碳储量的减少。扭转这种下降趋势的土地管理策略是必要的，但我们并没有充分理解土壤有机碳积累和损失的详细机制。这阻碍了更好的土地管理战略的发展，并给预测气候变化反馈的模型带来了不确定性。此外，土壤是陆地生物圈中最大的碳库，其含碳量是大气中的两倍，表层土壤(0-30厘米)含碳量约占一半。土壤微生物通过分解土壤和植物有机质来调节有机碳的储存和释放，在土壤碳通量中起主要作用。新的研究表明，对这种微生物调节的更好了解可能对预测土壤有机碳的变化至关重要，从而改善对气候变化反馈的预测。一种新的范例也认识到微生物生物量对有机物积累的直接、显著贡献，由此微生物残留物被转化为稳定的有机碳部分。然而，微生物生理学对其生物量生产和最终在土壤中的持久性的影响仍然存在不确定性。这强调了探索有机碳储存的生态和生物化学基础的必要性，重点是微生物特征——它们的表型特征。
气候变化导致的微生物特征的变化已被证明对土壤有机碳的储存有影响。微生物碳利用效率(CUE)或生长效率，即微生物吸收的底物碳与呼吸作用中损失的底物碳的比例，是决定土壤中碳命运的关键性状。最近的理论表明，较高的微生物生长效率可能表明，通过相对较大的生物量合成，这些群落储存土壤有机碳的能力增加，从而增加了可用于稳定的微生物残留物的数量。增加微生物对资源获取的投资（以胞外酶生产的形式降解复杂的底物）被认为会导致较低的生长效率。同样，缓解土壤酸性或水资源减少等压力的生理适应可能导致维持能量需求增加，从而降低生长效率。然而，迄今为止，在复杂资源的使用和获取、对压力的适应和生物量生产之间的微生物特性权衡还没有被探索过。我们认为，这些权衡在决定土壤中碳输入过程方面很重要。
不同微生物种群的共同特征通过它们之间的相互作用以及它们与环境之间的相互作用来调节生态系统的功能。我们现在有证据表明，土壤性质的梯度，如土壤pH，是土壤微生物多样性的强大驱动力。因此，我们假设沿着相似的梯度，在群落水平上可能影响CUE的微生物生理生态特征存在差异。对这种经验趋势的了解可能是更好地理解土地管理对土壤有机碳储存影响的关键。确定土地管理对土壤微生物生态生理学的一致影响是困难的，因为土地利用的强化及其对土壤性质(如土壤pH、容重和含水量)的影响往往因地点和环境而异。文献综述中的性状估计提供了跨土壤CUE变异性的理论和经验基础，并表明微生物效率是化学计量约束、底物质量和数量、土壤生物多样性和土壤性质的综合衡量标准。然而，我们仍然不能自信地建立微生物CUE和环境变量之间的经验关系。这使得很难预测CUE的时空模式，而这种模式是提高微生物对人为变化的生理生态反应的关键。
本研究的总体目标是评估土地利用强度对景观土壤梯度上微生物生理生态特征的影响，并评估微生物性状权衡对土壤有机碳积累的影响。为了实现这一目标，我们分析了从英国56个分布点(图1)采集的土壤中的微生物特征，这些分布点位于温带生境，土地利用从低强度物种丰富的草地到高强度草地和农田。我们使用回归和路径分析来识别潜在的微生物对有机碳积累的生理生态控制和相关的环境驱动因素。利用稳定碳同位素示踪和土壤宏蛋白质组学，我们证明了在低和高土壤pH下土壤有机碳积累的两种不同机制。这些机制强调了微生物生长和代谢效率对土壤有机碳积累的重要性。这一集体知识使土地使用强化引起的土壤pH变化能够作为用于确定土地管理战略对微生物土壤碳循环过程的影响的代用指标。
3 主要结果：
3.1 微生物生理学和土壤碳之间的联系。
我们首先测试了微生物生态生理学和土壤性质之间更广泛的关系，使用碳浓度作为有机碳积累的指标，了解微生物过程如何决定有机物质输入的矿化、同化和积累，而有机物质输入是有机碳形成和流失的基础。对于从全英国56个空间分布点的景观梯度上取样的土壤(每个点三个重复)，我们观察到某些微生物生态生理学测量(生物量估计和特定呼吸)和有机碳浓度。然而，在群体水平上的底物CUE，以13C标记的植物凋落物DOC掺入微生物DNA的比例相对于作为呼吸性CO2损失的比例来测量，似乎是由多种土壤特性的相互作用驱动的，不能用单一的线性模型来组合。然后，我们通过回归树分析使用递归分割来解开交互；在所测定的土壤特性中，最好的分配参数是土壤pH，其中还包括土壤水分、粘土含量、碳氮浓度和碳氮比(补充图1)。在pH 6.2下使用CUE与SOC线性回归的斜率失效测试（逐次回归）确定阈值(补充图2)。换句话说，这里测定的群落CUE在pH值为6.2的阈值范围内明显不同；超过这个值，群落CUE和有机碳浓度共同变化，表明微生物生长效率和有机碳积累的相互依赖（图2a）。CUE-SOC关系在pH阈值下破裂，在pH阈值下，酸度和湿度对微生物生长的限制在有机物积累中可能更为重要。在这种酸性土壤中，微生物的周转或生长率(单位时间内新形成的DNA的数量)非常低（图2b），但是呼吸反应在整个土壤酸碱度范围内没有差异（图2c）；两者都与以前的研究一致。在pH值较低的土壤中，有一种从生长到维持呼吸的转变，这是一种权衡，即增加对生理策略的投资，以便在经常潮湿和氧气有限的酸性环境中生存(补充图3)。我们还注意到，在这种土壤中，周转率的降低与有机碳浓度的增加有关（图2b）。微生物生长的减少减缓了分解，导致植物和微生物有机物的积累。酸性土壤中微生物生物量积累较高的证据来自于观察到这些土壤中的总微生物DNA库相对于新形成的DNA的量较大。这些结果强调了在研究微生物降解和有机物积累时，同时考虑生长速率（单位时间产生的子代数量）和效率（单位资源消耗产生的子代数量）的重要性。
图1. 采样点的地理分布。英国各地的土壤采样位置显示在英国土壤酸碱度图上，该图是在R软件下使用地图工具和gstat软件包创建的；酸碱度数据来自英国土壤门户(ukso.org)。对56个地点的土壤进行了取样，并对21个地方土地利用进行了对比，以研究土地利用强化的影响。地图上邻近地点的符号重叠。
在所有土壤中，呼吸熵（qCO2）随着SOC浓度的降低而增加（图2c），同位素示踪法测量的证据证实了微生物生长效率和有机碳积累相互依赖性。在有机碳含量较高的土壤中，微生物生物量作为土壤总DNA-C浓度的测量值较高（图2d），突出了微生物生物量与有机碳之间的正相关关系。我们注意到，与使用其他生物标志物的方法相比，使用DNA-C浓度作为生物量的替代可能导致低估总微生物生物量和微生物CUE的绝对值。尽管乙酰酯酶的潜在活性与有机碳之间呈正相关，但观察到与单位生物量的酶产量呈负相关(图2e)。因此，在较高的土壤pH下，增加CUE与底物获取中胞外酶投入的减少有关（图2a,e）。这验证了生理权衡理论，即在有机资源枯竭的土壤中微生物酶投资的增加会导致生长效率的降低。这些在土壤物理化学条件和土地利用强度上变化的关系提供了大量的经验证据，直接将微生物生态生理学与土壤的碳储存潜力联系起来。我们还观察到分类指标(如细菌α多样性)与有机碳浓度之间的显著关系（图2f）；然而，这些与关键生理生态特征的相关性弱于土壤有机碳。这表明群落水平的生理性状可能比评估的分类多样性指数更强地耦合到有机碳积累；使用结构方程模型对此进行了进一步的测试。
图2 微生物参数与土壤碳的关系。微生物群落CUE的回归趋势——碳利用效率(a)、周转或生长率(b)、生物量特异性呼吸或qCO2 (c)、作为生物量代表的DNA-C浓度(d)、胞外酶投资(e)和细菌分类丰富度(f)与土壤景观尺度梯度上的SOC浓度的关系。来自所有56个位点的数据，每个位点有三个重复，在此作为独立点(红圈:pH<6.2；蓝圈:pH > 6.2)。在c–f中，在阈值pH值为6.2时，没有微生物特征的划分，黑色回归线包括所有数据点。最佳拟合回归模型为:a pH < 6.2: n=50，y=0.0004x+0.01，pH > 6.2: n=113，y = 0.01 x+0.02；b pH < 6.2:y = - 0.02 ln(x)+0.05，pH > 6.2:y = - 0.21 ln(x)+0.55；c所有数据:n=163，y = 0.16 e -0.12x ;d所有数据:y = 5.09 x- 0.07；e所有数据:y = - 1.37 ln(x)+4.87；f所有数据:y=11.06x+962。
3.2 不同的SOC在pH阈值上的累积机制。
递归分割和广义线性模型的经验趋势表明，在土壤pH阈值约为6.2时，这里评估的站点的有机碳积累有两种不同的机制: 在高于pH阈值的站点，更高的微生物生长效率导致微生物生物量增加，从而导致更大的有机碳积累; 并且在低于阈值的站点，pH、酸度和湿度(补充图3)导致微生物生长速率较慢(图2b)，这限制了现存有机物的分解。我们试图通过结构方程模型的路径分析来验证这些机制。采用验证性的方法，我们旨在测试微生物多样性和生态生理学对SOC积累的直接和间接影响，以及上述不同的因果关系。从独立测定的细菌和真菌α多样性中得出一个潜在的生物多样性变量作为共同因素。这里的多样性只是作为一个单变量预测因子来表示这些大的多变量分子数据集。基于分类多样性驱动性状反应的观点，我们分析了一个路径结构，高代谢效率导致更大的微生物生物量，从而导致更高的土壤碳积累。该模型仅适用于高pH土壤（图3）。当pH值低于阈值6.2时，该模型结构不能充分反映我们的数据集，从而否定了潜在的因果链，并表明CUE、微生物生物量和碳积累之间的关系解耦。因此，生长效率和高生物量与有机碳积累相关的理论在酸性土壤中并不成立。在这里，微生物的生长或周转对碳分解是一个更大的限制，导致更高的有机物积累，尽管群落表现出较低的生长效率。
图3 预期因果关系的模型结果。通过结构方程模型对土壤pH阈值为6.2的两组数据进行拟合，得到了最适合的因果关系路径(pH < 6.2: n=50, CFI=1, RMSEA=0, SRMR=0.079, AIC=693, P=0.67; pH > 6.2: n=113, CFI=1,RMSEA=0, SRMR=0.039, AIC=1396, P=0.57). 变量旁边的百分比数字表示它们的解释方差(R2)。箭头上的数字表示标准化的路径系数，星号表示它们的显著性；***<0.001。
3.3 土地集约利用的微生物生理响应。
这里调查的土壤来自一系列的土地利用类型，从长期农业改良很少的永久性草地(低强度)到集约管理的草地或耕地(高强度)。为检验土地集约利用对土壤微生物群落生态生理的影响，在本次调查中，我们使用了21个本地配对的低强度和高强度土地使用对比(表1，补充表1)。
鉴于我们的主要目标是针对土地利用强度存在长期差异的土壤，这些差异通常会导致土壤性质（如SOC含量）的巨大变化，我们没有收集详细的当前植物性质，如净初级生产力、植物多样性和投入的化学成分。相反，我们评估了土地使用强化对土壤特性的影响，并使用观察到的土壤理化性质参数变化来评估微生物的生理生态反应。土地利用强度从原始草原到集约农业系统通常会增加土壤的pH，并且通常导致土壤碳浓度降低、保水性降低和土壤结构变差。我们观察到类似的结果（图4a-c）。土地集约利用对微生物生态生理学没有一致的全球影响，土地集约利用对微生物生态生理学没有一致的全球影响，并且在不同的土地利用对比中，变化的方向也不一致。更精细的评估指出了与上述土壤pH阈值微生物碳循环的不同机制相关的特征趋势。土地利用强化的效果取决于土壤pH变化的数量和方向。因此，我们确定了土地利用强度对土壤性质的各种影响产生的以下三类效果。
土地利用集约化的第一种效应:植物生产力在土壤pH范围较高时最高，使这种土壤更有利于农业；证据表明，集约经营下的土地覆盖面积随着平均土壤pH1的增加而增加。在研究的高pH(> 6.2)地点，土地利用强化导致向碱性转变，微生物群落CUE通常降低，生长率增加(图4a)，表明向代谢浪费的共营养生命策略转变。由此导致的微生物生物量的减少和呼吸熵(qCO2)的增加可能与集约土地利用系统中的有机碳损失有关。
土地利用集约化的第二种效应:酸性土壤石灰化是一种广泛的农业实践，用于提高这种土壤对植物生产的适应性。在我们研究的低pH站点，土地利用强化导致土壤pH超过阈值(低强化的点:pH< 6.2，邻近的更强化的点:pH> 6.2)，微生物CUE和周转率在更强化的土壤系统中都较高，微生物生物量减少，呼吸熵增加(图4b)。这表明微生物生理学从低强度酸性土壤中维持呼吸的优势向高强度pH土壤中生长和分解的增加转变。我们假设，在这样的集约土壤中，有机碳的损失并不是微生物生长效率提高的反映，而是微生物生长的酸性阻滞作用减弱的结果，这表明生长速率的增加导致有机质分解的增加30。
土地利用集约化的第三种效应:这包括pH地点(pH< 6.2)，在那里，在强化过程中土壤pH的增加没有超过6.2的阈值。相对于高pH站点，两种土地利用对比中的微生物CUE和周转率都较低，强化导致两个参数都有小幅下降(图4c)。这与我们假设的低pH土壤中的有机碳积累机制一致，在低pH土壤中，由于酸度和较高的土壤含水量，微生物的生长和分解速率较低(图2b)。
表1土地利用对比特征
3.4 特性权衡对SOC积累有影响。
土壤宏蛋白质组学用于确定微生物控制土壤碳转化的生理基础。这是通过分析三种土地利用强化效应的代表性土地利用对比的功能变化实现的(表1)。对于类型1效应(上述两种土壤的pH值均高于6.2），肽谱分析显示，较原始的土地利用系统具有数量显著较高的ABC转运蛋白（KEGG 1级：环境信息处理），包括一般L-氨基酸、支链氨基酸、二/寡肽、核糖和甘油的转运系统底物结合蛋白，表明底物吸收和同化的补救途径（图5a，b）。相反，强化系统中有机底物的可用性较低，反映在ABC转运蛋白的相对丰度较低，与维持途径相关的蛋白质丰度较高，例如大小亚基核糖体蛋白质合成、氨基酸合成、嘌呤代谢（DNA定向RNA聚合酶亚基），产生能量的氧化磷酸化蛋白，如ATPase（图5b）。因此，资源获取的补救途径的减少，导致对非生长维持活动的更高投资，如用于资源获取的蛋白质/酶的分子周转，以及为这些活动提供燃料所需的能量生成途径。高强度土壤中的微生物群落也将更高比例的资源和能量投入到应激缓解中，表现为伴侣蛋白指标如GroEL等胁迫蛋白质指标的显著增加（1级：遗传信息处理，3级：RNA降解；图5a，b）。这些分子伴侣通过重折叠或降解应激诱导的错误折叠蛋白质来防止蛋白质聚集。增加细胞对缓解压力的投资与降低微生物生长效率(如CUE所示)进行了权衡(图4a)。因此，尽管在较高土壤pH值下密集土壤系统中的土壤群落具有更大的周转率，但低生长效率意味着在维持呼吸过程中，更多的有机质输入被矿化和损失（图4a）。这种对微生物平衡的生态生理学理解进一步重申了微生物对高pH土壤碳循环的重要控制作用。在这种集约系统中，提高微生物生长效率的土壤管理策略可以帮助最大限度地增加有机物积累和土壤碳储存。我们建议，覆盖作物和其他旨在增加土壤中植物碳输入的恢复性保护方法将在一段时间内促进微生物介导的反复土壤有机质形成，并减少资源限制和水分胁迫。我们的功能评估表明，这将降低微生物生长的代谢限制，导致微生物生长效率的正反馈，导致底物进入生物量合成的通道增加，从而促进额外的土壤有机质积累。
受胁迫环境（如耕地）中的微生物代谢限制在土地利用集约化的第二种效应中也很明显（增加土壤pH值超过6.2的阈值），但其机制是不同的。第二类情景下蛋白质指标的频率和相对丰度的差异突出了几种生理适应。集约土地利用系统中酸度和水分水平的降低导致微生物周转增加(图4b)，这也反映在对许多代谢途径的投资增加，以满足活性微生物种群的能量和生物合成需求(图5a)。集约土地利用系统中酸度和水分水平的降低导致微生物周转增加(图4b)，这也反映在对许多代谢途径的投资增加，以满足活性微生物种群的能量和生物合成需求(图5a)。这些包括大小亚单位核糖体蛋白合成、糖酵解和TCA循环等中枢代谢途径、氧化磷酸化、嘌呤代谢和氨基酸生物合成(图5b)。高强度土壤中ABC转运蛋白，特别是支链氨基酸和磷酸盐的转运系统也有所增加，这是由于现存有机质降解增加，从而提高底物质的利用率。属于伴侣蛋白GroEL和分子伴侣DnaK（3级：RNA降解）家族的不同胁迫蛋白质被确定为高强度和低强度土地利用处理的指标，但作为耐酸性反应，它们在酸性较强的低强度土壤中的相对丰度显著更高。在低强度土壤中，随着代谢效率的降低，对缓解胁迫的投资增加，重申了微生物功能特性的权衡。
图4 土地利用对土壤性质和微生物特征的影响。在土地利用强化效应的假设类别中，各种土壤特性和微生物生理特性的倍数变化。此处显示的是21个可比较的当地土地利用对比(对比数量—类型1 (a): 11、类型2 (b): 6和类型3 (c): 4；表1)的土地利用强化测量参数的倍数变化，其计算方法为低强度和高强度处理的平均参数值的比率，每个重复三次。灰色点代表每个对比度的折叠变化平均值，彩色点代表所有对比度的平均值，中间值由方框内的垂直线标记，箱线图显示每个参数的四分位数，线段延伸到所有对比度的最高值和最低值。虚线是表示土地利用对比中相同参数值的边界。
在土地利用集约化的第三种效应中，两种对比都低于阈值pH值6.2，成对蛋白质指标分析显示土地利用强化的功能指标较少，因为两种系统相似(图5a)。关键指标是在高强度土壤中含量更高的胁迫蛋白；值得注意的是，这些是所有三种土地利用对比中集约土地利用系统的全球指标，以前在农业系统中有过报告。如前所述，在低pH土壤中，微生物对土壤碳循环过程的控制作用要低得多，微生物周转率较低就是证明。然而，土壤微生物持续呼吸，可能使用非植物碳源，如直接碳固定，尽管我们没有从蛋白质组分析中发现任何关于碳呼吸氧化还原策略的证据。观察结果强调，微生物生理权衡是微生物对土壤有机质形成贡献的关键决定因素，因此需要进一步测试，以充分理解土壤碳积累的生物化学基础。然而，我们提出了强有力的证据，证明微生物性状的这种权衡在近中性土壤中很重要，这是大多数生产性农业发生的地方。
图5 土地利用变化的功能指标。三个有代表性的土地利用对比中土地利用变化的成对蛋白质指标，每个指标都属于假设的土地利用强化效应:a KEGG主要功能分类中每个土壤的蛋白质指标的频率；b在3级分类中，数量最多的蛋白质指标的相对丰度，较暗的色调表示较高的丰度。每个对照由低和高土地利用强度处理组成，每个处理重复三次
4 结论
我们在关键微生物生态生理特征和土壤碳浓度之间建立了景观尺度的经验联系，支持微生物在地下碳循环中的中心作用。结果表明，一个有效的微生物生理学与生物合成分配更大比例的底物，表现在这种社区的能力，储存碳在接近中性的土壤酸碱度增加。微生物生理特性的权衡决定了微生物有机碳投入生物合成的比例。在压力和资源限制的情况下，生长和生物合成下降，而细胞投资在侧重于压力耐受性和资源获取的性状上要高得多。我们发现这些土壤在6.2的酸碱度阈值范围内有两种不同的土壤碳积累机制:在较高的酸碱度(> 6.2)下，有效的底物代谢导致有机碳积累增加；在酸性潮湿环境中(pH6.2)，非生物因素限制了微生物的生长和分解，导致有机碳的积累。这一证据支持使用土壤酸碱度作为土地利用变化、母质和气候的综合代表，以确定土地管理策略对土壤有机碳积累的特定地点效应。这些机制突出了微生物生态生理调控对高酸碱度土壤有机质积累的重要性。结果表明，在接近中性pH的土壤中，一种有效的微生物生理学，其底物分配比例更大，表现为这些群落储存C的能力增强。微生物生理特性的权衡决定了微生物有机碳投入生物合成的比例。在压力和资源限制的情况下，生长和生物合成下降，而细胞投资在侧重于压力耐受性和资源获取的性状上要高得多。我们发现这些土壤在pH阈值6.2范围内有两种不同的土壤碳积累机制:在较高的pH(> 6.2)下，有效的底物代谢导致有机碳积累增加；在酸性潮湿环境中(pH＜6.2)，非生物因素限制了微生物的生长和分解，导致有机碳的积累。这一证据支持使用土壤pH作为土地利用变化、母质和气候的综合代表，以确定土地管理策略对土壤有机碳积累的特定地点的影响。这些机制突出了微生物生态生理调控对高pH土壤有机质积累的重要性。在这里，集约度较低的土地管理措施通过提高微生物生长效率，使底物更多地进入生物质合成，从而具有更大的土壤碳储存潜力。在低pH土壤中的强化可以减缓与酸相关的微生物生长和有机质降解的阻滞，导致微生物分解过程中碳的大量损失。在这些系统中，保存等量的有机碳将涉及管理非生物碳积累因素，如酸度和湿度，同时提高植物产量。因此，我们强调，在设计旨在通过集约农业实践减少土壤碳流失的恢复性土地管理战略时，必须考虑土壤微生物的生理属性。
5 材料和方法
采样设计：土壤样品采集自56个地理分布不同的土壤性质的地点(图1)。从这些地点中，选择了21个当地土地利用强度与土地管理方案相关历史知识的对比，以研究土地利用强度对微生物功能的影响(表1)。研究实验、工作农场或由当地野生动物信托基金管理的农场旨在提供两个不同长期管理强度的附近田地。低强度地点通常是永久性的未改良草地，通常是低密度放牧。高强度的地点大多是可耕种的肥沃农田或集约草地。21个局部对照的子集是根据高强度处理显著减少有机物和增加pH的标准选择的，反映了全国范围内的强化效应趋势(表1，补充表1)。在一个时间点，从每个确定的地点取样三个空间分散的土壤样品(直径5厘米，深度15厘米)，以获取每个地点的自然空间变异性。移除所有可见的根后，将等分的均质土壤在20℃下冷冻，直到进行以下功能分析。
土壤化学：使用标准方案，在每个地点的采集的土壤样品中评估烧失量(LOI)、碳、氮、pH、水分和粘土含量。土壤全碳浓度与LOI密切相关(R2=0.93)，唯一的偏差是高无机碳的石灰性土壤。对于来自这些地点的土壤，总碳是基于非碱性地点的LOI-C回归模型预测的。土壤pH在去离子水中测量，水分含量用重量法测定。
微生物呼吸：对于微生物基础呼吸测量，将一份(1 g)田间潮湿土壤放入10毫升玻璃瓶中，在室温(21℃)下黑暗中培养过夜(约16小时)，无需控制湿度水平。使用气相色谱同位素比率质谱仪(德国IRMS德尔塔+ XL公司)测量顶空中收集的呼吸性二氧化碳，该质谱仪与具有通用接口的PAL自动进样器(CTC Analytics公司)相连。基础呼吸测量后，打开装有土壤的小瓶，在黑暗中培养8小时，然后加入100微升13C标记的DOC溶液(0.13毫克)。过滤灭菌溶液由13C标记的粉末状植物落叶制备而成，含有一系列可分解性不同的化合物。落叶是由生长在13C大气中的温带草本植物产生的(约1原子%13C，400 ppm)45。按照上述相同的培养过程重复呼吸测量，以获得吸入CO2中DO13C的比例。
微生物生物量，CUE和周转率：土壤微生物总DNA-C碳浓度被用作生物量碳的替代物；按照制造商的说明，使用PowerSoil-htp 96孔土壤DNA分离试剂盒对0.25克的土壤等分试样进行DNA提取(英国MO BIO实验室)。在加入25微升 DO13C溶液后，进行另一组相同的DNA提取，并在田间湿度下在黑暗中培养(16小时)。在液相色谱-同位素比率质谱仪LC-IRMS（通过LC-IsoLink接口与Delta+XP IRMS耦合的HPLC系统；德国赛默飞世尔科学公司）上以尺寸排除色谱（SEC）模式对两种提取物进行分析。这使我们能够从添加和不添加底物的土壤中获得DNA-C碳含量和微生物DNA中DO13C的比例。微生物CUE估计为DNA-13C/(DNA-13C +∑CO2-13C)，其中∑CO2-13C是呼吸过程中损失的累积DO13C。微生物周转率(同义称为生长率)计算为DNA-13C/DNA-C。
分类多样性：使用Illumina MiSeq平台，使用等分的DNA进行16 s rRNA基因和ITS区域标记的扩增子测序，以使用双指数方法分别估计细菌和真菌的分类多样性47,48。扩增子测序的原始序列经过质量过滤、合并和聚类，产生序列相似度为97%的OTU序列。丰富度是使用R vegan库对稀有数据（2000次读取）进行计算的。
胞外酶测定：乙酰酯酶的潜在活性通过使用荧光底物的普通分析方案来估计。乙酰木聚糖酯酶是土壤中最相关的乙酰酯酶；它属于催化木聚糖(硬木和一年生植物中的主要半纤维素)脱乙酰化的水解酶家族，因其参与复杂植物底物解聚的初始阶段而被选中。简而言之，使用在20毫升去离子水中振荡的1.5克均质土壤获得土壤洗涤物。所得浆液用于使用4-甲基伞形科乙酸酯酯酶底物进行酯酶活性测定。反应在28℃下进行3小时，每30分钟进行一次荧光测量(BiOSp8自动培养箱)。荧光强度用与自动培养箱相连的Cytation 5分光光度计测量。
宏蛋白质组学：对于微生物群落的蛋白质组学分析，从高强度和低强度土地利用中使用了三个重复样本，由六个地点组成，每个对照代表三种假设的土地利用强化效应之一(表1)。使用SDS缓冲液-苯酚提取法，将总共5 g土壤用于蛋白质提取(有两个技术重复)。蛋白质提取物用1D SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，所得产物经胰蛋白酶消化。蛋白水解切割的肽在通过反相纳米高效液相色谱在纳米高效液相色谱系统(终极3000 RSLC纳米系统，Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)上进行质谱分析之前被分离，该系统与配备有纳米电喷雾离子源(美国纽约州伊萨卡市的Advion Triversa Nanomate)的高精度高频质谱仪(美国加利福尼亚州圣荷西赛莫费希尔科学公司)在线耦合用于分析。质谱仪器的原始数据使用Proteome Discoverer v1.4.1.14 (Thermo Fisher Sciental)进行搜索，并使用SEQUEST HT算法与FASTA格式的数据库(细菌、真菌和古细菌的蛋白质编码序列，Uniprot 05/2016)进行比较。数据库搜索以半胱氨酸上的氨基甲酸乙酯化作为固定修饰，甲硫氨酸上的氧化作为可变修饰。使用10 ppm肽离子和0.02 Da质谱/质谱容差，选择对胰蛋白酶具有最多两个缺失切割的酶特异性。只有由过滤器50估计的错误发现率(FDR)小于1%的肽和只有1级肽被接受为已鉴定肽。Unipept v3.251被用于将蛋白质分配到它们的系统发育起源。GhostKoala和KEGG分类器用于功能注释。
回归分析：统计分析在R软件2.14.0下进行。使用rpart包对整个数据集(56个地点)进行回归树分析，根据土壤性质递归划分微生物CUE数据，包括土壤pH值、水分、总碳氮浓度、碳氮比和粘土含量。这里，来自每个位点的所有三个重复被独立处理，以说明空间非独立性。通过土壤pH窗口在1.4个单位范围内的反复移动，以0.1个单位的增量，对CUE土壤C线性回归进行简单斜率试验（Slope failure test）或分段回归。pH阈值被确定为土壤碳回归系数R2急剧下降之前的最后一个pH单位(补充图2)。在确定阈值pH后，将数据分为低(< 6.2，n= 50)和高(> 6.2，n= 113)，并对两个数据集分别运行各种生理性状和土壤碳的广义线性模型。
结构方程模型：通过将数据集组织成一个路径关系网络，来检验微生物多样性和生态生理学对土壤碳积累的直接和间接影响。使用验证性方法，我们旨在测试数据符合推测微生物分类和功能影响土壤碳积累的假设路径模型的最大似然性。作为预测变量的微生物功能性状包括CUE和生物量，微生物分类学的潜在变量是使用细菌和真菌α多样性产生的。路径模型的拟合和与数据的结构关系通过使用R包进行SEM来验证。最简约的模型通过非显著性X2检验(P≥0.05)、赤池信息量准则(AIC)、低近似指数均方根误差(RMSEA ≤ 0.1)、低标准化均方根残差指数(SRMR ≤ 0.1)和高比较拟合指数(CFI ≥0.90)来识别。
处理效果的分析：为了评估土地使用强化的效果，我们确定了21个选定的土地使用对比(42个地点，每个地点有三个重复)中所测微生物特征的数量和变化方向。每种对比的强化倍数变化计算为低强度和高强度处理的平均性状值的比率。由于未能阐明任何全球模式，我们根据对土壤C循环的机械理解，将数据分为高于和低于假设阈值土壤pH值的对比类型和土地利用集约化导致土壤pH值从低于阈值到高于阈值的第三类对比类型阈值（表1，图4a–c）。
蛋白质指示剂分析：成对指示物种分析用于确定蛋白质功能(来自土壤宏蛋白质组学)，其与每个对照的低强度和高强度土地利用处理显著相关。这是在R实现的(http://ecology.msu.montana.edu/labdsv/R)。每种蛋白质的IndVal分数是每种土地利用处理中相对频率和相对平均丰度的乘积，显著性通过随机重新分配组(1000个排列)来计算。
数据可用性：作者声明，支持本研究结果的数据可在文章及其补充信息文件中获得，并可根据要求从相应的作者处获得。当前研究中生成的质谱蛋白质组学数据可通过PRIDE合作伙伴知识库在蛋白质组交换联盟中获得，数据集标识符为PXD010526。
6 参考文献：
Malik A A, Puissant J, Buckeridge K M, Goodall T, Jehmlich N, Chowdhury S, Gweon H S, Peyton J M, Mason K E, van Agtmaal M, Blaud A, Clark I M, Whitaker J, Pywell R F, Ostle N, Gleixner G and Griffiths R I 2018 Land use driven change in soil pH affects microbial carbon cycling processes. NAT COMMUN 9.