众里寻“肽”千百度——短肽药物筛选系统

短肽作为药物有许多显而易见的好处，比如和蛋白类靶标有很好的亲和性、易于构建突变库等。但是由于短肽构象不稳定、无法跨膜、容易被蛋白酶降解等不利因素，少见线性短肽类的成药。Christopher Voigt课题组在本文中为我们展示了一个在细胞中高效筛选可以识别特定蛋白靶标的线性短肽的系统。

短肽药物筛选系统

短肽作为药物有许多显而易见的好处，比如和蛋白类靶标有很好的亲和性、易于构建突变库等。但是由于短肽构象不稳定、无法跨膜、容易被蛋白酶降解等不利因素，少见线性短肽类的成药。Christopher Voigt课题组在本文中为我们展示了一个在细胞中高效筛选可以识别特定蛋白靶标的线性短肽的系统。

细胞中线性短肽的合成方式主要有两种，一是通过非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetases, NRPSs）合成，另一种是通过核糖体在细胞中翻译和修饰得到肽链（ribosomally synthesized andpost-translationally modified peptide, RiPPs）。虽然人们通过NRPSs途径确实发现了一些很重要的药物，比如雷帕霉素、达托霉素等，但是NRPSs途径确实很难得到多种多样的短肽突变体，也就无法完成高通量筛选。RiPPs途径在这一方面却能够很好的展现其独特的优势，它像正常蛋白一样由基因编码，只需要构建基因的突变库就可以得到多种多样的RiPPs。不过RiPPs的产生需要一些特定的序列和酶催化，这限制了它的广泛使用。

图|细胞中RiPPs成熟的过程

细胞中RiPPs需要由前体肽经过修饰形成核心结构域，随后再被蛋白酶降解掉前导肽等线性片段，最后得到成熟的RiPPs。因此若要构建一个RiPPs文库，首先要找到一个合适的修饰酶来催化核心结构域的形成。

在本文中Voigt课题组使用了来自Paenibacilluspolymyxa（多粘类芽孢杆菌）的PapA/PapB肽酶对，PapB可以催化PapA肽中半胱氨酸（C）和谷氨酸（E）或天冬氨酸（D）残基之间形成硫醚大环结构，而且不受其余氨基酸残基种类的影响。

基于PapA/PapB肽酶对的性质，Voigt课题组构建了一个可以由PapB催化的13 aa肽的核心结构，其中固定了两个C和两个D/E的位置，其他位置的氨基酸可以随意编码，都以X表示，由NNK（N表示四种碱基均可，K表示T或G两种碱基）密码子随机编码，由于其中包括两个固定的C，这种短肽被重新命名为Pap2c。

图|Pap2c的序列示意图

理论上这个短肽文库可以达到1012左右的大小，不过由于电转化方法的限制，每次转化只能得到108大小的文库，但这也足够完成筛选了。

筛选系统使用了来源于Nostocpunctiforme（点形念珠藻）的一种蛋白质内含子Npu，在Npu的N端分别连接蛋白靶标和σ因子的N端，C端分别连接待筛选的RiPPs和σ因子的C端。当RiPPs能够识别并结合到蛋白靶标上时，Npu的两端会组合到一起，释放出σ因子的N端和C端形成完整有功能的σ因子去激活下游的报告基因表达。

图|筛选系统的示意图

利用这套定向进化系统，Voigt课题组筛选出来一种短肽并将其命名为AMK-1057，它可以特异性地靶向COVID-19的S蛋白的RNA结合区域。

Voigt最初的目的是想要找到一种可以和人ACE2蛋白竞争结合S蛋白的短肽来抑制COVID-19侵入人体细胞的过程，但筛选得到的AMK-1057的结合位置与ACE2并不冲突。尽管没有找到合适的短肽，但这仍然是一种不错的尝试，为药物设计提供了一条新的思路。通过这个技术我们可以直接针对病原菌的某个关键蛋白去定向进化出新的短肽抗生素，或者结合蛋白酶体系统去靶向降解病原蛋白等。

目前市场上最常见的短肽药物通常是一些激素或递质类似物，而且往往都是通过理性设计在天然产物的基础上衍生的。但实际上短肽药物在其他方面有着十分广阔的使用场景。

与传统的短肽药物设计方法相比，本文的方法可以完成高通量筛选，更加高效的针对特定靶标寻找到合适的药物；与传统的蛋白定向进化系统相比，本文提到的定向进化体系聚焦于短肽及其结合靶标蛋白的能力，使得这种方法可以成为一种通用方法，即所有想要筛选针对特定蛋白的短肽药物的研究都能使用该系统。

尽管这个筛选系统还不够成熟，例如还不能针对靶标蛋白上的具体结构域或motif筛选短肽，但是笔者仍然认为这是一种很新奇很有潜力的新技术。

References:[1] King AM, Anderson DA, Glassey E, et al. Selection for constrained peptides that bind toa single target protein. Nat Commun. 2021;12(1):6343.[2] Arnison PG, BibbMJ, Bierbaum G, et al. Ribosomally synthesized and post-translationally modifiedpeptide natural products: overview and recommendations for a universalnomenclature. Nat Prod Rep. 2013;30(1):108-160.[3] Hegemann JD,Bobeica SC, Walker MC, Bothwell IR, van der Donk WA. Assessing the Flexibilityof the Prochlorosin 2.8 Scaffold for Bioengineering Applications. ACS SynthBiol. 2019;8(5):1204-1214.

#感谢李楠老师的指导

李楠，副研究员，博士生导师，中科院深圳先进技术研究院合成生物学工程研究中心PI。他于厦门大学化学化工学院化学生物学系获得学士学位，于荷兰莱顿大学数学与自然科学学院获得硕士和博士学位，在欧洲分子生物学实验室（EMBL）和德国癌症研究中心（DKFZ）从事博士后研究。其实验室主要研究方向是化学蛋白质组学在合成生物学与分子药理学中的应用。研究成果发表在Nat Protoc, Curr Opin Chem Biol, Nat Methods, Leukemia，ACIE等国际知名期刊。 

联系方式：0755-86704727

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个人网站：http://isynbio.siat.ac.cn/chemoproteomics/ 

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撰文 | 李昱昶

校对 | 董宇轩

编辑 | 李佩芸

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