由“冷”转“热”，看细菌如何变身“肿瘤新抗原”搅弄风云

胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是胰腺癌的主要病理类型，其恶性程度高，患者预后差，因此被称为“癌中之王”。患者接受早期胰腺手术和吉西他滨（gemcitabine, GEM）辅助化疗后，五年生存率仅为27%。对于新型的免疫治疗，如检查点抑制剂、CAR-T、肿瘤疫苗等，临床上也收效甚微。主要原因是PDAC为典型的“冷”肿瘤，其肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME)含有大量骨髓来源的抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）和肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）。此外，PDAC的肿瘤突变负荷较低，缺乏有效的肿瘤新抗原（neoantigens）。
2022年3月23日，来自爱因斯坦医学院的研究人员在Science Translational Medicine上发表了一项重要研究成果。该团队开发了一种利用细菌载体，递送回忆抗原（recall antigen）的新型肿瘤免疫疗法。研究者在PDAC小鼠模型中，腹腔注射了减毒的单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes, Listeria），该细菌会靶向聚集到肿瘤的原发部位和转移灶，在肿瘤细胞周围表达破伤风类毒素（tetanus toxoid, TT）。由于小鼠此前已经接种过破伤风疫苗（类比儿童计划免疫中的百白破疫苗），免疫系统会将TT视为“肿瘤新抗原”，显著增加肿瘤内CD4+T细胞的浸润，促进IFN-g、穿孔素和颗粒酶B的大量分泌，降低TME中MDSCs和TAMs的数量。在与化疗药GEM联合治疗后，小鼠的肿瘤负荷和转移分别降低了80%和87%，生存率提高了40%。
图 1 | 论文首页截图

Listeria是一种兼性厌氧的革兰氏阳性菌，是食物中毒的常见病原体之一。早在2013年，该团队就发现减毒的Listeria可以通过感染MDSCs迁移到转移性乳腺癌细胞中。由于血液及正常组织中的免疫系统可以快速清除Listeria，因此Listeria只能定殖在免疫抑制的肿瘤组织中。目前，FDA已经批准了多项以Listeria为载体递送肿瘤特异性抗原的临床试验。但对于缺乏肿瘤新抗原的“冷”肿瘤而言，细菌疗法仍然面临巨大的挑战。
►首先，为了克服肿瘤抗原的问题， 研究者将破伤风梭菌来源的TT蛋白中的一部分无毒片段（856-1313aa）融合表达在李斯特溶菌素上（listeriolysin O, LLO），构建了重组表达TT的Listeria（LM-TT）。随后通过腹腔注射10^7 CFU（colony-forming unit）的LM-TT，在分别用小鼠（Panc-02）和人癌细胞（Mia-PaCa2）构建的两种胰腺癌小鼠模型中，均检测到LM-TT大量聚集在肿瘤原发部位和转移灶。此外，活体多光子显微镜证明肿瘤细胞和巨噬细胞能够摄取带有荧光抗体标记的LM-TT。

图2 |  经腹腔注射后，LM-TT主要聚集在肿瘤组织

►随后，研究者开始验证LM-TT以及LM-TT联合化疗药GEM在PDAC小鼠中的治疗效果。在构建肿瘤模型前，小鼠会提前肌肉注射两次破伤风类毒素疫苗（TTvac），从而模拟儿童免疫接种中也含有破伤风类毒素的百白破疫苗（由百日咳菌苗、白喉类毒素及破伤风类毒素按一定比例配制而成,可同时预防百日咳、白喉、破伤风三种疾病）。

图3 |  实验流程图

注射LM-TT后，研究者通过免疫组化染色检测到了LM-TT在肿瘤组织中的表达情况，由于导管上皮表达的磷脂酶A和B对细菌的生长具有促进作用，所以TT主要存在于胰腺导管周围。更重要的是，联合使用的GEM不仅能显著提高TT的表达水平，还能提高CD4+T细胞的浸润水平。

图4 | LM-TT和GEM治疗后，肿瘤组织的TT表达水平和CD4+T细胞浸润增加

为了检测LM-TT的免疫原性，研究者通过酶联免疫斑点试验（Enzyme Linked Immunospot Assay, ELISPOT）发现注射LM-TT的小鼠脾脏淋巴细胞能够被TT刺激，分泌大量的IFN-gammar。这表明LM-TT激活了此前TTvac诱导的记忆性T细胞（Memory T cell, Tm）。此外。用磁珠将CD4+或CD8+T细胞分别去除后，IFN-g的分泌显著降低，特别是CD4+T细胞，这说明CD4+T细胞在免疫激活过程中发挥更重要的作用。

图5 | LM-TT能够诱导TT特异性的细胞免疫反应

►于是，研究者进一步探究了CD4+T细胞的定位和功能。结果显示，CD4+T细胞不仅存在于肿瘤组织，还大量存在于周围的淋巴结样结构（lymph node–like structures, LNS)中，分泌具有肿瘤杀伤作用的穿孔素（perforin）和颗粒酶B（granzyme B）。同时，GEM会促进LNS的形成，显著增加CD4+T细胞在LNS中的数量。

图6 | CD4+T存在于肿瘤和LNS中，具有细胞杀伤能力

除此之外，研究者通过流式细胞术发现LM-TT和GEM治疗能够显著降低肿瘤中MDSC（CD11b+Gr1+）和TAM（CD11b+ F4/80+）的细胞数量。而RNA-seq结果表明LM-TT显著提高了肿瘤组织中免疫应答、细胞死亡、MHC基因等通路的反应水平。这说明LM-TT有效改善了TME的免疫抑制环境，将“冷”肿瘤转变为了“热”肿瘤。

图7 | LM-TT和GEM改善了小鼠胰腺癌的免疫抑制环境

►最后，在保护率方面，研究者通过PET扫描发现原发肿瘤和转移灶的吸收值（SUVmax）在LM-TT和GEM治疗后显著降低，表明肿瘤活动度下降。并且，小鼠的生存时间延长了约2个月。在注射CD4和CD8 的抗体后，肿瘤的大小和转移显著增加，特别是在使用CD4+T细胞抗体后。这再次表明CD4+T细胞在LM-TT的抗肿瘤机制中，发挥比CD8+T细胞更重要的作用。

图8 | LM-TT和GEM能够降低肿瘤活动度，延长小鼠生存期

综上，研究者利用肿瘤靶向的Listeria细菌载体，开发了一种“回忆抗原”的肿瘤免疫疗法。原理如下图所示，在接种破伤风疫苗后，免疫系统产生了TT特异性的记忆性CD4+T细胞。在机体产生肿瘤后，Listeria-TT一方面能够借助MDSC靶向聚集到肿瘤细胞中，使TT成为“肿瘤新抗原”；另一方面，TT能够被DC细胞呈递，激活体内的记忆性CD4+T细胞，从而杀伤含有TT的肿瘤细胞。

图9 | TTvac和Listeria-TT的抗肿瘤机制

目前，尽管多种免疫治疗在肿瘤中取得突破性进展，但老年患者的有效率却始终低于年轻患者。这主要是由于初始T细胞(Naïve T cell,Tn)会随着年龄的增加而逐渐减少。相反，记忆性T细胞能够长期存活在骨髓中，且不会随着年龄的增加而下降。因此，以记忆性CD4+T细胞为对象的细菌疗法无疑为胰腺癌这类难治性“冷”肿瘤提供了新的研究思路和治疗策略。

参考文献：[1] Selvanesan BC, Chandra D, Quispe-Tintaya W, et al. Listeria delivers tetanus toxoid protein to pancreatic tumors and induces cancer cell death in mice. Sci Transl Med. 2022;14(637):eabc1600. doi:10.1126/scitranslmed.abc1600[2] Chandra D, Jahangir A, Quispe-Tintaya W, Einstein MH, Gravekamp C. Myeloid-derived suppressor cells have a central role in attenuated Listeria monocytogenes-based immunotherapy against metastatic breast cancer in young and old mice. Br J Cancer. 2013;108(11):2281-2290. doi:10.1038/bjc.2013.206[3] Forbes NS, Coffin RS, Deng L, et al. White paper on microbial anti-cancer therapy and prevention. J Immunother Cancer. 2018;6(1):78. Published 2018 Aug 6. doi:10.1186/s40425-018-0381-3

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撰文 | 赵文龙

校对 | 董宇轩 岳震

编辑 | 李佩芸

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