蛋白质设计：计算助力肽异二聚体全新设计

肽异二聚体由于其独特的空间构象，被广泛应用于功能性复合体的模块化构建以及化学与合成生物学分子工具开发。目前，肽异二聚体的合成主要基于疏水相互作用和氢键等低亲和性的非共价键作用，其会导致不稳定性解离和浓度依赖性非特异性聚合，极大地限制了肽异二聚体的应用范围。而二硫键作为一种稳定的共价结合化学键，能大幅提高多肽之间的相互作用强度，更加有利于异二聚体的形成。然而，实现分子间二硫键精准配对对化学合成方法及计算辅助从头设计都是一项巨大的挑战。
2022年3月22日，厦门大学化学化工学院吴川六与华盛顿大学生物化学系蛋白设计研究所David Baker、苏州大学基础医学与生物科学学院姚宏伟合作在《自然通讯》杂志发文，报道了一种结合计算生物学的二硫键桥肽异二聚体从头设计和定向折叠方法[1]，该方法结合Rosetta[2](由David Baker实验室开发的用于蛋白质结构计算建模和分析的算法套件，囊括了蛋白质从头设计、酶设计、配体对接及生物大分子结构预测等诸多计算结构生物学方法和能量函数)和基于Rosetta开发的残基配对转换（residue-pair transform, RPX）模型[3]，设计并实现了五种通过二硫键连接的肽异二聚体，表现出了良好的特性及应用的潜能。
图1 | 论文标题截屏
使用二硫键连接两条肽链，首先需要在两条肽链中分别引入含有巯基（-SH）的氨基酸残基，同时两个巯基之间应易于氧化脱氢形成二硫键。作者发现，半胱氨酸（Cysteine）和青霉胺（Penicillamine）在氧化剂硒代胱氨酸（Selenocysteine）存在下,能很快发生反应且收率达到了82%，同时可有效减缓相同化学位的巯基之间形成二硫键。
图2 | 半胱氨酸与青霉胺在硒代胱氨酸存在下发生反应
基于以上对二硫键化学合成的认识，作者结合计算生物学对其进行设计优化。
首先，将RPX模型应用于肽链中半胱氨酸和青霉胺插入位置筛选中。作者从PDB数据库中选取了30,000个含有二硫键的天然蛋白并经过随机扰动来增强数据，通过计算骨架原子和二硫键配对残基及附近原子的相对空间位置分布来建立基于哈希方法的数据库。这就相当于建立了能形成二硫键的局部空间结构的标准库。当一种新的蛋白结构被加载进来时，模型会逐个计算两两残基之间的相对空间状态，当计算结果与数据库中的某种结构匹配度达到一定阈值，该对残基就被认为可以用来构建半胱氨酸-青霉胺二硫键。
图3 | RPX模型架构示意图
其次，得到可能的二硫键构建位置后，经过改造的蛋白结构被送到Rosetta中进行结构优化。由于Rosetta集成了统计模型及热力学能量函数，具有很好的结构设计和预测性能，使得经过两轮设计及优化后的肽异二聚体具有很好的结构和功能。
图4 | Rosetta设计所得结构与核磁共振解析结构匹配度示意图
整体设计架构完善之后，作者首先选择了一种富含二硫键区域的天然蛋白,1kv0,进行选择性改造：1）去除冗余的不含二硫键的区域；2）在两个β折叠之间引入一个β转角诱导基序；3）在β折叠中引入半胱氨酸到青霉胺的突变；4）在α螺旋末端构建一个非天然的半胱氨酸-青霉胺二硫键；5）进行计算序列设计。通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）及圆二色谱等分析发现，设计得到了结构稳定、由二硫键桥连接的肽异二聚体hd1。通过同样的方法，作者设计得到了其他四种具有代表性的肽异二聚体hd2、hd3、hd4、hd5。
图5 | 设计所得肽异二聚体结构示意图
得到以上五种肽异二聚体以后，作者进一步验证了它们之间的正交性，以验证能否在同一个体系中同时应用。通过两种单体及三种单体分别混合进行氧化反应后发现，hd1、hd3、hd4两两正交，hd2、hd3、hd4两两正交，即单体混合反应后得到的异二聚体不存在相互杂合的情况。由于hd1和hd2在β折叠区域高度相似，混合反应后会得到副产物，不具备正交性。鉴于以上的正交性，作者通过一段柔性的linker串联了hd1和hd3，得到了串联的肽异二聚体，通过消化连接的linker又可以获得单独的肽异二聚体，使得合成和操作更加灵活。
图6 | 肽异二聚体正交性验证
最后，作者对肽异二聚体潜在的应用进行了讨论。由于其具有共价结合的高稳定性，可以用来做蛋白标记。作者尝试了不同的标记方式：1）对一个蛋白融合一种肽异二聚体单体，在另一种单体末端标记荧光。单体通过硒代胱氨酸氧化形成二硫键，使得功能蛋白带上荧光标记。同时，氧化过程是可逆的，在还原剂存在下又可破环二硫键，得到不带有荧光标记的功能蛋白，使得功能蛋白荧光淬灭。2）在含有不同蛋白的同一体系中同时用多种肽异二聚体进行标记，由于它们之间的正交性，能够得到相对应的特殊标记蛋白，可用于复杂体系中多种蛋白表达的验证。3）对同一个蛋白同时进行荧光及生物素标记，即在功能蛋白两端分别融合两种肽异二聚体单体，经过和带有荧光和生物素标记的单体的氧化反应，可以得到同时标记有荧光和生物素的蛋白，可用于表达验证并纯化。
图7 | 肽异二聚体作为蛋白质标记物
综上所述，作者结合Rosetta和RPX模型，提出了一种基于半胱氨酸和青霉胺巯基在硒代胱氨酸存在下氧化形成二硫键的肽异二聚体从头设计和定向折叠方法，是计算指导生物设计的又一种尝试，也是目前生物设计过程迈向数据驱动及理性探索的一种尝试。通过二硫键提高肽异二聚体的稳定性，使得其有望在蛋白组装及功能化、疫苗设计、药物递送和二聚肽治疗方法发挥重要作用。

参考文献[1]. Yao S, Moyer A, Zheng Y, et al. Denovo design and directed folding of disulfide-bridged peptide heterodimers. NatCommun. 2022;13(1):1539. Published 2022 Mar 22. doi:10.1038/s41467-022-29210-x[2]. O'Meara MJ, Leaver-Fay A, Tyka MD,et al. Combined covalent-electrostatic model of hydrogen bonding improvesstructure prediction with Rosetta. J Chem Theory Comput. 2015;11(2):609-622.doi:10.1021/ct500864r[3]. Fallas JA, Ueda G, Sheffler W, etal. Computational design of self-assembling cyclic protein homo-oligomers. NatChem. 2017;9(4):353-360. doi:10.1038/nchem.2673

-----作者 | 王鸿奎校对 | 岳震编辑 | 李佩芸

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