构建高效生物传感器，合成生物学工程化改造蛋白

CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，充当了防御外源遗传物质的“基因武器”，其与Cas蛋白作用，造就了细菌具备“精准打击”功能的免疫系统。经过优化改造的Cas蛋白一直是基因工程领域“一家独大”的“宠儿”。而究其工作机制，无非是DNA或RNA激活一种具有核酸剪切功能的酶并依赖DNA或RNA碱基互补配对原则实现靶向性的蛋白活性开关。
大自然鬼斧神工地创造了CRISPR-Cas家族，那我们能否用合成生物学的思路来仿照大自然构建一个具备特定DNA序列响应特性的蛋白活性开关呢？
2022年4月18日，纽约州立大学北医科大学生物化学与分子生物学系Sekhon与Loh在Cell旗下新子刊Cell Reports Methods发表文章 “Engineering protein activity into off-the-shelf DNA devices” [1]，融合NanoLuc荧光素酶(nLuc)、绿色荧光蛋白突变体mNeonGreen(mNG)和酵母转录因子GCN4的双链DNA结合域，成功构建了响应GCN4识别序列AP-1的高效生物传感器。并在此基础上，通过不同的DNA序列改造方式，可以设计响应血清素、ATP，甚至实现双输入逻辑门的生物传感器。
值得一提的是，鉴于nLuc极强的发光特性，不需要任何昂贵的精密仪器，用一部普通的手机就能实时观察实验现象，再也不用因为预约不到仪器而黯然神伤了。
图1 文章标题截图
再简要谈谈其设计思想。
天然的nLuc只能发出蓝光，如果只用其发光强度变化来表征响应物的浓度等特性，呈现的结果不太直观且很难用合适的数学方程来拟合，于是作者在nLuc的N端融合了绿色荧光蛋白mNG。同样的，天然的nLuc也没有特异性识别DNA序列的功能，自然而然的想法就是融合一个具有特异性识别DNA序列功能的结构域，作者选择了GCN4。
GCN4的插入位置有一定的考究，其既能通过与AP-1的结合与否来改变融合蛋白的空间构象，又不能影响蛋白正常发光特性。作者在这里选择了一种交替框架折叠模型(Alternate-frame-folding，AFF)[2]，该模型思想是通过“复制”天然蛋白一端的一个结构域到另一端，如复制nLuc的N端序列6-50到C端，并用一段柔性linker连接，使其中间的结构域既能和N端，也能和C端结构域组成完整蛋白结构且都具备生物活性。
其结果是，在体系中没有AP-1时，GCN4呈无序状态，nLuc51-171与N端的nLuc6-50形成完整的nLuc，并发出蓝光；而此时，nLuc与mNG距离较近，nLuc发出的蓝光会通过生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy trasnsfer，BRET)激发mNG发绿光，整个体系呈现绿色。而当GCN4结合AP-1时，其会形成刚性的空间结构，使得nLuc51-171只能和C端的nLuc6*-50*形成完整结构，发出的蓝光无法激发远距离的mNG，整个体系呈现蓝色。
图2  设计思想示意图
-----作者 | 鸿鹄居士校对 | 捉蝴蝶的猫编辑 | 李佩芸
参考文献[1]Sekhon and Loh, Engineering proteinactivity into off-the-shelf DNA devices, Cell Reports Methods (2022), https://doi.org/10.1016/j.crmeth.2022.100202[2]Mitrea DM, Parsons LS, Loh SN. Engineeringan artificial zymogen by alternate frame protein folding. Proc Natl Acad Sci US A. 2010;107(7):2824-2829. doi:10.1073/pnas.0907668107

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