【免费干货】一个HPLC还能玩出什么花样？前处理，流动相，一环必须扣一环！
液相色谱是一类分离与分析技术，其特点是以液体作为流动相，固定相可以有多种形式，如纸、薄板和填充床等。在色谱技术发展的过程中．为了区分各种方法，根据固定相的形式产生了各自的命名，如纸色谱、薄层色谱和柱液相色谱。
色谱法是指按物质在固定相与流动相间分配系数的差别而进行分离、分析的方法。在流动相从固定相的一端流到另一端的过程中，加在固定相起始端的溶质随流动相流动，并在流动相和固定相之间来回转移。不同的溶质与这两相的亲和力大小不同，溶质的移动速度也不同，因而得到分离。固定相一般是固体，也可以是固体上附着液体；流动相是液体或气体。
高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析更有优势。常用的柱子即C18（反相柱），（正相柱和反相柱的区别：本质上是固定相的不同，正相柱填料及性强，洗脱顺序由弱到强，反相柱固定相极性弱，洗脱顺序由强到弱），常见的检测器为紫外检测器。
它的主要优点是
（1）分辩率高于其它色谱法；
（2）速度快，十几分钟到几十分钟可完成；
（3）重复性高；
（4）高效相色谱柱可反复使用；
（5）自动化操作，分析精确度高。
根据分离过程中溶质分子与固定相相互作用的差别，高效液相色谱可分为四个基本类型，即液－固色谱、液－液色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱。
高效液相色谱在生物领域中广泛用于下列产物的分离和鉴定：
（1）氨基酸及其衍生物；
（2）有机酸；
（3）甾体化合物；
（4）生物硷；
（5）抗菌素；
（6）糖类；
（7）卟啉；
（8）核酸及其降解产物；
（9）蛋白质、酶和多肽；
（10）脂类等。
1：由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。
2：三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。
3：粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。
样品最好使用流动相溶解样品；使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质；使用0.45µm的过滤膜过滤除去微粒杂质
1．溶剂萃取
在色谱分析样品制备中，溶剂萃取方法主要有液-液萃取、液-固萃取和液-气萃取，它们都是属于两相间的传质过程，即物质从一相转入另一相的过程。
2．固相萃取（solid phase extraction SPE）
固相萃取（SPE）是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离。然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的
3．固相微萃取（solid phase micro-extraction SPME）
固相微萃取（SPME）是在固相萃取上发展起来的一种新型、高效的样品预处理技术，它集采集、浓缩于一体，简单、方便、无溶剂，不会造成二次污染，是一种有利于环保的很有应用前景的预处理方法。与液液萃取和固相萃取相比，具有操作时间短，样品量小，无需萃取溶剂，适用于分析挥发性与非挥发性物质，重现性好等优点。
以上是较为常见的三种方式，此外还有微波萃取技术（micro amplitude extraction MAE），加速溶剂萃取（accelerated solvent extraction, ASE）等，就不在此赘述了。
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