【红外光谱数据分析】定期连载！蛋白质二级结构分析（二）

上一期主要介绍了红外光谱在蛋白质二级结构的应用案例「红外光谱数据分析 || 定期连载！蛋白质二级结构的分析（一）」。其实细心的同学会发现，案例中的图片往往都是整篇文章的核心亮点，凭借红外光谱蛋白二级结构分析，加上美美的图片，就能发表一篇3分以上的SCI。
为了进一步给同学们打好相应的基础，这里用一期推文介绍审稿人在类似文章中给的常见审稿意见。
首先，是红外光谱分析蛋白质二级结构中数据处理的三部曲：

• S1：采集样品光谱图；
• S2：谱图预处理；
• S3：分峰拟合。

看似简单的三个步骤，往往暗藏诸多玄机！往往稍有不慎，就会接到审稿人的各种审稿意见。
常见审稿意见和意见解答

审稿人问题一：为什么没有展现原始光谱图/原始光谱图质量这么差，分析结果可靠吗？

意见解答：不同样品处理方法和测试手段得到的光谱图有着较大差异，只有高质量的光谱图才能得到准确的结果。而二级结构的光谱图只展示了1700~1600cm^-1波段的局部光谱，建议加上4000~400cm^-1的光谱图，说明测试的光谱数据准确可靠。
常见质量较差的光谱图有以下几个特点：a. 光谱图酰胺I带毛刺多，噪音干扰大；b. 样品中酰胺I带的吸收峰相对强度过低，其他成分对其吸收峰产生了一定影响。 高质量蛋白质光谱（酰胺I带吸收峰平滑无毛刺，峰形好，相对强度高）

审稿人问题二：有没有扣除蛋白质样品中其他成分或溶剂的影响，例如水？实验步骤里为什么没有相应的解释或描述呢？

意见解答：这是蛋白质二级结构分析中最常见的问题。部分官能团的吸收峰也会出现在1700~1600cm^-1波段，与酰胺I带的吸收峰重叠，从而增加数据分析的误差。例如水中O-H弯曲振动（1630cm^-1），化合物的C=O、C=C伸缩振动等。
为了提高分峰拟合后数据的准确性，常见方法有：a.提纯蛋白质样品；b.谱图差减扣除杂质成分干扰。 O-H弯曲振动峰会与酰胺I带重合

审稿人问题三：退卷积前为什么要进行平滑处理？考虑到谱图处理对光谱畸变的影响了吗？

意见解答：审稿人的真实目的是想了解作者是否充分了解红外光谱的仪器原理和数据采集等基础知识。红外光谱采集的原始开始是干涉图，经过傅里叶变换后能得到光谱图，由于样品、仪器和信号处理等因素会产生各种光谱噪声。平滑处理会以牺牲细节处光谱变化和造成光谱畸变为代价，消除光谱中噪声的影响。但酰胺I带1700~1600cm^-1处子峰信号微弱，平滑处理会掩盖子峰的信号，因此这里不建议平滑处理。

审稿人问题四：退卷积后为什么会产生多余的子峰，是处理带来的误差吗？

意见解答：退卷积能放大各二级结构子峰的信号，便于分峰拟合。但要注意，退卷积处理同样会造成光谱图的畸变，错误的参数选择也会带来较大的分析误差，尤其是不要处理后产生多余的子峰（例如在靠近1700cm^-1或1600cm^-1处产生多余子峰）。

审稿人问题五：光谱图处理后光谱子峰数目不一致，会影响实验结果吗?

意见解答：二级结构分析中，能让审稿人一眼挑错的就是光谱图处理后子峰数目不一致。由于不同的波段对应不同的蛋白质二级结构，不合适的拟合方法和参数会造成同一组样品的光谱图的子峰数目不一致，影响子峰相对强度变化的连续性，给不同二级结构的相对含量的计算带来误差。建议从光谱预处理和分峰拟合两个步骤中，调整合适的参数，尽量保证处理后光谱中子峰的数目一致。

审稿人问题六：计算各二级结构相对含量时，建议多次实验，计算误差棒！

意见解答：一旦提出这个问题，往往意味着需要补实验了。为了提高实验数据的可信度，审稿人往往会建议作者在画二级结构相对含量变化图时加上误差棒。但相应的，这意味需要补实验，同时工作量要增加5倍以上。具体如下：一个样品需要测试5组以上的光谱数据，再进行分峰拟合，计算二级结构相对含量，最后计算出误差棒。建议开始实验时就给同一样品采集多组光谱数据，提前计算好误差棒再投稿。

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