WB实验过程中出现的常见问题全面解析！

在实验的过程中或者结果处理的时候，我们通常会遇到许多的问题，对于一些常见的问题我们做了汇总和原因分析，希望能够帮助到大家。

01

 电泳中的问题

出现问题	原因
条带呈笑脸状 (︶)	凝胶不均匀冷却，中间冷却不好 迁移过快，电泳系统温度偏高
条带呈皱眉状 (︵)	可能是由于装置不合适 特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡 或者凝胶两边聚合不完全
拖尾	样品溶解不好
条带偏斜	电极不平衡或者加样位置偏斜
条带两边扩散	加样量过多

02

Western blot 结果中信号弱或无信号

可能的原因	建议
蛋白未转到膜上	转膜结束后，用总蛋白染色剂染胶来确定转膜效率 确保转膜过程中胶与膜完全接触 确保转印夹层排布正确 使用正对照和/或分子量 Marker 可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头 适当调整转膜的时间和电流优化转印时间和电流
一抗、二抗等不匹配	订购试剂时 认真选取一抗与组织种属 一抗与二抗或/ 和底物与酶系统之间相匹配的 抗体及底物 可通过设置内参验证二级检测系统的有效性
一抗或/和二抗浓度低	增加抗体浓度 延长抗体孵育时间 抗体可能失活 可用斑点印迹检测其活性
洗膜过度	洗膜时间不宜过长 加入的去垢剂不宜过强或过多 建议使用 0. 05% 的弱去垢剂  Tween-20
曝光时间太短	延长胶片的曝光时间 （注意：超感应化学发光底物会持续发光至少 6 个小时）
过度封闭	使用含 0.5% 脱脂奶粉或无脱脂奶的抗体稀释液 试用不同的封闭液 减少封闭时间

03

Western blot 结果中杂带较多

或特异性条带位置不对

可能的原因	建议
细胞传代次数过多 使其蛋白表达模式的分化	使用原始或传代少的细胞株或平行实验
目的蛋白有其它剪切本	查阅文献或生物信息学 分析可能性
上样量过高，太敏感	适当减少上样量
一抗特异性不高	重新选择或制备高特异性的抗体
蛋白存在二聚体或多聚体	SDS-PAGE 电泳上样前 煮沸 10 min 以增强蛋白质解聚变性

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