“氮”测定 || 氨基酸态氮、氨基糖态氮、铵态氮、酸解性总氮、非酸解态氮

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氨基酸态氮

氨基酸是土壤氮素中已知的数量最多的一类化合物，α-氨基酸，非α-氨基酸和N-苯氧基氨基酸态氮总计，高的约占土壤全氮量的56%。这些氨基酸中极少量的以游离态存在，绝大多数以结合态存在，其中有的是土壤中微生物的一部分，有的是腐殖物质的组成部分，有的被吸持在黏土矿物的表面上。

方法选择：双指示甲醛滴定法和电位滴定法。

一．酸水解-蒸馏法

土壤样品与6M HCI在100℃下共同加热12小时，用碱中和至中性，获得供分析用的酸水解液。随后通过茚三酮氧化法测定释放出的氨，即可得到氨基酸态氮的量。原理为，凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肤、氨基酸的溶液与水合苟三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤：第一步是氨基酸被氧化形成 CO₂、NH₃和酸，茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH₃ 缩合生成有色物质。最后，通过分光光度计即可测得氨基酸态氮的量。

图1：土壤检测

二．双指示甲醛滴定法

方法原理：氨基酸具有酸型的-COOH基和碱性的-NH₂基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH₂基于甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸态氮的量。

三．电位滴定法

方法原理：根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧酸显示出酸型，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值来判断和控制滴定终点。

图2：电位滴定法

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氨基糖态氮

氨基糖以粘多醣的结构成分存在，而且能与粘肤和粘蛋白以及小分子物质，如抗菌类物质结合在一起。氨基糖在土壤中可能起双重作用，既作为植物生长的能源，又能促进形成良好的土壤结构。土壤酸水解产物中存在氨基糖是Bremner最早提出来的，其认为土壤中氨基糖氮的主要组成是葡萄糖胺，其次是乳糖胺。1959 年 Sowden 指出，葡萄糖胺和乳糖胺之和，接近于土壤总氨基糖 N 量， N-乙酞葡糖胺所占的比例很小。葡糖胺与乳糖胺的比值，一般变化在 1.6-4.1 之间。以后人们又在土壤中检测出其 N-甲基-L-葡萄糖胺、 D-岩藻糖胺、 L-岩藻糖胺、胞壁酸、 2-胺-2-脱氧甘露糖醛酸、氨基葡萄糖醛酸、氨基半乳糖醛酸。由于氨基糖很少在高等植物组织中发现，主要存在于真菌和昆虫的几丁质结构成分中，昆虫壳在耕地土壤中很少，因此，微生物细胞壁物质是土壤氨基糖的主要来源。在好气性土壤中，绝大部分的氨基糖类是以复合物状态存在，它们是不均质的多分散系大分子化合物。土壤中的另一部分氨基糖是紧密地和无机胶体结合着的。

一．酸水解-蒸馏法

方法原理：土壤样品预处理与上述操作相同。基于葡糖胺和半乳糖胺在形成铵的碱性介质中会很快地被分解，所以采用磷酸钠-硼酸缓冲液（pH=11.2）进行蒸馏，减去铵态氮后经较正即可得到氨基糖态氮的含量。

二．色谱法

方法原理：在吡啶-甲醇溶液中，以4-二甲氨基吡啶为催化剂的条件下与盐酸羟胺和乙酸酐发生糖腈乙酰酯反应，所得衍生物可利用气相色谱测定。

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铵态氮

土壤酸水解产物中出现相当量的铵态氮。其来源比较复杂，其中一部分是无机态（包括土壤吸附性铵及固定态铵），另一部分则可能是在酸水解过程中，某些氨基酸，特别是天门冬氨酸、谷氨酸、含硫氨基酸及氨基糖的脱氨基作用，再一部分才是来自酞胺类化合物。有学者认为，这个组分的铵态氮究竟有多少来自氨基酸或酞胺类是很难鉴别的，并认为土壤酸水解产物中的按态氮仍有一半左右的来源不清楚。

一．KCl浸提-蒸馏法

方法原理：用2mol/L KCl浸提土壤，把吸附在土壤胶体上的NH₄⁺及水溶性NH₄⁺浸提出来。取一份浸出液在半微量定氮蒸馏器中加MgO（MgO是弱碱，有防止浸出液中酰铵有机氮水解的可能）蒸馏。蒸出的氨以H₃BO₃吸收，用标准酸溶液滴定，计算土壤中的铵态氮含量。

二．KCl浸提-靛酚蓝比色法

方法原理：KCl浸提操作与上述相同。土壤浸提液中的铵态氮在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚作用，生成水溶性染料靛酚蓝，溶液的颜色很稳定。在含氮0.05-0.5mol/L的范围内，吸光度与铵态氮含量成正比，可用比色法测定。

酸解性总氮

土壤中的氮大部分以有机态（蛋白质、氨基酸、腐殖质、酞胺等）存在．无机态（氨氮、硝氮、亚硝氮）含量极少，总氮量的多少决定于土壤腐殖质的含量。

一．凯氏定氮法

方法原理：土壤中含氮有机化合物在还原性催化剂的作川下．用浓硫酸消化分解，使其中所含的氮转化为氨，并与硫酸结合为硫酸氨。给消化液加入过量的氢氧化钠溶液，使铵盐分解蒸馏出氨，吸收在硼酸溶液中，最后以甲基红-溴甲酚绿为指示剂，用标准盐酸滴定至粉红色为终点．根据标准盐酸的用最．求出分析样品中的含氮总量。

图3：凯氏氮蒸馏装置

二．半微量开氏法

方法原理：样品在加速剂的参与下，用浓硫酸消煮时，各种含氮有机化合物，经过复杂的高温分解反应，转化为铵态氮．碱化后蒸馏出来的氨用硼酸吸收，以酸标准溶液滴定，求出土壤全氮含量（不包括全部硝态氮）。

包括硝态和亚硝态氮的总测定，样品消煮前，需先用高锰酸钾将样品中的亚硝态氮氧化为硝态氮后，再用还原铁粉使全部硝态氮还原，转化成铵氮。

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酸解性未知态氮

酸解未知态氮的来源至今报导很少，它的形态和性质均不清楚。有以下一些研究结果。土壤中约有 1/4-1/2的酸水解未知态氮是以非α-氨基酸态氮的形态出现的，Greenfield根据简单蛋白质水解结果首先论证了这种形态氮素的存在。己有一些材料表明，这种形态的氮分别占土壤和胡敏酸的酸解未知态氮的20％-49％和14％-40％。有些酸解未知态氮是非蛋白质组分的氨基酸，如瓜氨酸、β-氨基丙酸、鸟氨酸、肌酸（可能来自土壤微生物和动物细胞）等。

差减法

方法原理：酸解未知态氮是用差减法求得，由酸解总氮减去氨基酸态氮、铵态氮和氨基糖态氮所得。

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非酸解态氮

关于非酸解态氮，通常认为是由杂环化合物氮、非苯系合物氮和苯系化合物氮组成，占非酸解氮的比率分别为37.5％-52.5％、10.6-26.7、31％-35.2%左右，以杂环氮含量最高。研究表明，酸解未知态氮为类黑素氮或称氨基酸缩合氮，不是非酸解氮的成分，而是与糠醛联结的氨基酸在水解过程中缩合的产物。

差减法

方法原理：非酸解态氮由土壤全氮减去酸解总氮得到。

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