【详解】色谱法——科研生必用的分析方法！

色谱法的由来

色谱法的创始人是俄国的植物学家茨维特（M.Tswett）。1906年，俄国植物学家茨维特发表了他的实验结果：为了分离植物色素，他将含有植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸钙颗粒表面的吸附力不同，随着淋洗的进行，不同色素向下移动的速度不同，从而形成一圈圈不同颜色的色带，使各色素成分得到了分离。他将这种分离方法命名为色谱法(chromatography)。

色谱法是非常重要又常用的分析方法，今天小编带大家来补充基础知识。

伟大的茨维特

植物叶色素的分离实验

色谱柱—玻璃柱 

固定相—CaCO3颗粒

流动相—石油醚  

随着分离手段的不断发展，越来越多的无色物质成为被分离的对象，色谱也渐渐失去了“色”的含义，但这个名称却沿用至今。

色谱法介绍

色谱分析法（Chromatography）简称色谱法或层析法，是一种物理或物理化学分离分析方法，该法利用某一特定的色谱系统（薄层色谱、高效液相色谱或气相色谱等系统）进行混合物中各组分的分离分析，主要用于分析多组分样品。

▪ 固定相：在色谱分离中固定不动，对样品产生保留的一相。

▪ 流动相：带动样品向前移动的另一相。

色谱法分类

按两相物理状态分类

▪ 流动相：气相色谱、液相色谱、超临界流体色谱。

▪ 固定相：气－固、气－液；液－固、液－液。

按固定相的形式分类

▪ 柱色谱：填充柱色谱、毛细管柱色谱、微填充柱色谱、制备色谱。

▪ 平面色谱：纸色谱、薄层色谱、高分子膜色谱。

按分离机制分类

▪ 吸附色谱：根据不同组分在吸附剂上的吸附和解吸能力的大小而分离。

▪ 分配色谱：根据不同组分在固定液中溶解度的大小而分离。

▪ 分子排阻色谱：依据分子体积大小不同进行分离ln离子交换色谱：不同组分对离子交换树脂的亲和力不同而分离。

▪ 亲和色谱：利用生物大分子之间的存在的专一的特殊亲和力进行分离。

▪ 毛细管电泳：依据各组分淌度和（或）分配行为的差异进行分离。

▪ 手性色谱：用于手性药物的分离分析，可分为三类：手性衍生化试剂法；手性流动相添加剂法；手性固定相拆分法。

色谱法的基本术语

色谱分离过程

检测色谱分离后组分的响应信号对时间作图得到的曲线称为色谱图。

色谱流出曲线

▪ 基线：在一定色谱条件下，仅有流动相通过检测器系统时所产生的信号的曲线，称为基线，如图中ot线。实验条件稳定时，基线是一条平行于横轴的线；基线反映仪器（主要是检测器）的噪声随时间的变化。

▪ 峰高：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图AB线。

▪ 区域宽度：色谱峰的区域宽度直接与分离效率有关。描述色谱峰宽的方法有三种：标准偏差σ、峰宽W、半峰宽W1/2。 

▪ 标准偏差（σ）：σ为正态分布曲线上两拐点间距离之半，σ值的大小表示组分离开色谱柱的分散程度。 σ值越大，流出的组分越分散，分离效果变差；反之，流出组分集中，分离效果好。

▪ 峰宽W：通过色谱峰两侧的拐点作切线，在基线上的截距称为峰宽，或称基线宽度，也可用W表示，如图IJ 的距离。根据正态分布的原理 ，可证得峰宽和标准差的关系是W=4σ。

▪ 半峰宽W1/2：峰高一半处的峰宽称为半峰宽，如图 GH 的距离。W1/2=2.355σ，W=1.699W1/2。

W1/2、W都是由σ派生而来的，除用它们衡量柱效外，还用于计算峰面积。半峰宽测量较方便，最为常用。

色谱保留值、相对保留值与保留指数

▪ 保留值

是用来描述样品组分在色谱柱中保留程度的参数，并作为色谱定性的指标。其表示方法有：

▪ 相对保留值

又称分离因子、分配系数比或相对容量因子，即在一定色谱条件下，被测组分的调整保留时间（体积）与标准物的调整保留时间（体积）之比。

采用相对保留值是为了消除某些操作条件，如流速和固定液流失等，对保留值的影响。相对保留值中标准物可以是被测样品中的某一组分，也可以是人为加入的某一化合物。

▪ 保留指数

I为待测物质i在某固定液X上的保留指数，选取两个正构烷烃作为基准物质，其中一个的碳数为N，另一个为N+n，它们的调整保留时间分别为t’R(N)和 t’R(N+n)，使待测物质i的调整保留时间t’R(i)恰好于两者之间，即t’R(N)<t’R(i)<t’R(N+n)。将含物质i和所选的两个正构烷烃的混合物注入其固定液X的色谱柱，在一定温度条件下绘制色谱图。

保留指数的计算式为：

当相邻两个正构烷的碳数差值n=1时，保留指数或简化为：

容量因子与分配系数

1 容量因子（k）

在平衡状态下，组分在固定相(s)与流动相(m)中的质量之比，称为容量因子。公式如下： 

2 分配系数（K）

在平衡状态下，组分在固定相(s)与流动相(m)中的浓度之比，称为分配系数。公式如下：

K与k的关系：

保留值与容量因子及分配系数的关系

色谱分离是基于固定相对试样中各组分的吸附或溶解能力强弱的不同，而这种吸附或溶解能力的强弱可定量地用分配系数K（或容量因子k）值的大小来表示。吸附或溶解能力强的组分分配系数（或容量因子）大，保留时间长；反之，吸附或溶解能力弱的组分分配系数小，保留时间短。

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