J Haz Mat ：多巴胺纳米颗粒介导的点击化学触发的微粒计数免疫传感器用于检测赭曲霉毒素A

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赭曲霉毒素A是赭曲霉毒素中毒性最大的霉菌毒素。大量研究表明，赭曲霉毒素A对动物和人类具有肝毒性、肾毒性和致癌性。

此外，国际癌症研究机构(IARC)已将赭曲霉毒素A列为可能的人类致癌物。欧盟对赭曲霉毒素A有严格的最高限值，谷物产品为3 μg/kg，谷物为5 μg/kg。

因此，建立一种快速、准确的定量检测食品和农产品中赭曲霉毒素A的至关重要。目前已经开发了多种免疫学检测方法，其中，酶联免疫吸附试验（ELISA）因其简单、低成本和高通量读数而引起了广泛关注，但其检测性能高度依赖于催化活性和酶载量。

不幸的是，这些测定需要许多步骤来固定抗体。例如，抗体在载体上的共价固定需要使用1-乙基-3[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活化学基团，酶的脆弱性极大地阻碍了它们更广泛的应用。

因此，开发一种简单有效的生物偶联方法对霉菌毒素的无酶检测非常重要。

近年来，聚多巴胺（PDA）作为一种功能性纳米材料在生物医学科学、环境技术、表面改性和生物传感广泛应用。这些应用得益于PDA优异的生物相容性及其丰富的官能团。

PDA纳米粒子可以通过多巴胺(DA)在碱性溶液中的自氧化和聚合形成，这是一种简单且具有成本效益的制造策略。PDA NPs表面丰富的官能团可用于共价修饰。

正如先前报道的，抗体可以通过Michael加成和/或希夫碱反应共价连接到PDA表面，而不需要额外的激活剂或交联剂。有研究者提出抗体上的NH₂基团可以对不饱和羰基的C原子进行亲核攻击，导致抗体与PDA之间形成碳-氮双键。

因此，通过使用PDA NPs作为抗体偶联的载体，可以避免繁琐的偶联步骤。PDA NPs的另一个吸引人的特性是它们可以用作负载多价金属离子的锚点，例如Fe²⁺、Cu²⁺和Mn²⁺_。

因此，PDA NPs-抗体偶联物可以用作螯合金属离子的有效载体，并且可以使用它们在免疫测定和Cu²⁺浓度变化之间架起一座桥梁。

作为具有代表性的双正交点击化学反应，高选择性铜 (I) 催化的炔烃-叠氮化物环加成 (CuAA) 已被用作生物传感中的有效信号放大系统和生物共轭策略。CuAA以其反应速度快、条件温和、选择性好、效率高等优点被广泛应用于生化分析。

CuAA以其反应速度快、条件温和、选择性好、效率高等优点被广泛应用于生化分析。聚苯乙烯（PS）微球是一种稳定、廉价、尺寸均匀、悬浮稳定性好、易于改性的材料，因此也得到了广泛的应用。粒子计数用于分析粒子的大小和数量，灵敏度好、准确度高、测量速度快、读数直接。

粒子计数器基于库尔特原理，该原理指出粒子通过孔口会产生电压脉冲波动。脉冲信号的频率和波形与微粒的数量和大小密切相关。最重要的是，粒子计数技术可以通过产生不同的信号来区分粒子状态（分散或聚集）。

当一个PS微球簇通过一个传感区域时，聚集的粒子会产生一个复杂的信号，该信号与单个分散粒子的信号明显不同。因此，粒子计数技术可以提供一种方法来识别由叠氮化物-PS和炔烃-PS之间的点击反应触发的 PS 微球中的状态变化（从分散到聚集）。

文章详情

基于以上研究，华中农业大学食品科学技术学院陈翊平教授基于聚多巴胺纳米颗粒介导的点击化学开发了一种微粒计数免疫传感器（pMCI），用于灵敏检测赭曲霉毒素A。

在该测定中，合成单分散PDA NPs并与二抗(Ab₂)偶联。通过竞争性免疫反应，结合在96孔板表面上的PDA-Ab₂偶联物的量与赭曲霉毒素A的浓度成反比。一些Cu²⁺被PDA-Ab₂偶联物螯合。

然后将剩余的Cu²⁺通过L-抗坏血酸钠盐(SA)部分还原以获得Cu⁺。然后Cu⁺催化叠氮化物-PS和炔烃-PS之间的点击反应，将分散的叠氮化物-PS/炔烃-PS转化为聚集的PS簇，改变了粒子计数技术识别的粒子数量。

图1. 通过聚多巴胺纳米粒子介导的点击化学的粒子计数免疫传感器示意图。(A) 叠氮化物/炔烃功能化PS微球的制备方法；(B) 点击化学介导的粒子计数信号读数；(C)用于灵敏检测赭曲霉毒素 A 的微粒计数免疫传感器。

图2. PDA NPs的表征。(A, B) PDA NPs 的SEM图像，(C) DA和PDA NPs的紫外-可见吸收光谱，(D)PDA NPs和PDA-Ab₂的尺寸分布，(E) PDA-Ab2的EDS光谱。

图文解析

图3. 验证 PDA NPs 螯合 Cu²⁺。(A)Cu²⁺溶液的标准曲线 (n=3)；(B)吸附Cu²⁺ 与时间的关系(n = 3)；(C)吸附Cu²⁺后PDA NPs 的EDS光谱。

图4. PS-COOH、叠氮化物-PS和炔烃-PS的表征：（A）空白PS-COOH、叠氮化物-PS和炔烃-PS的傅里叶变换红外光谱；CuAA介导的PS：(B)CuAA之前分散的炔烃-/叠氮化物-PS 的扫描电子显微镜图像；(C) CuAA后聚集的PS簇的扫描电镜图像；(D) CuAA前后粒度分布图；(E) CuAA (n = 3) 前后 PS 数的变化。

图5. pMCI检测赭曲霉毒素A (n = 3)的分析性能：(A)标准曲线和(B)检测赭曲霉毒素A的pMCI 线性范围。酶联免疫吸附测定（ELISA）检测赭曲霉毒素A的性能（C）标准曲线和（D）ELISA检测赭曲霉毒素A的线性图。

图6. pMCI 的特异性。(一) 赭曲霉毒素A （OTA）、赭曲霉毒素B (OTB)、赭曲霉毒素C (OTC)、黄曲霉毒素B1 (AFB1)和黄曲霉毒素B2 (AFB2)的结构；(B) pMCI 使用 OTB、OTC、AFB1、AFB2 作为干扰物检测OTA的特异性(n = 3)。

图 7 PMCI 和 高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS)/MS 检测赭曲霉毒素A的结果：通过PMCI和HPLC-MS/MS 测量大麦和小麦样品中赭曲霉毒素A的量（n = 3）；ng/g 是干重。

结论

本文基于PS微球介导的信号读出探针和PDA NPs触发的点击化学，建立了一种微粒子计数免疫传感器。该免疫传感器在真实小麦、大麦样品中检测赭曲霉毒素A具有较高的灵敏度和准确性。

PDA NPs提供了一种简单有效的抗体偶联策略，简化了生物偶联过程，减少了抗体消耗。PDA纳米粒子是螯Cu²⁺离子的理想载体。点击配体修饰PS微粒为粒子计数提供了一种高效的信号探针，并提供了一种高灵敏度的信号读取系统。

然而，该方法仍有一定的局限性，不能同时检测多个目标。未来，微流控芯片和机器学习技术将进一步提高该免疫传感器的分析性能，拓宽其应用范围。

文献链接

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304389421031769

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