自1956年研究人员首次在细胞培养中发现支原体污染以来，支原体污染问题无处不在[1]。支原体污染非常不易察觉。有的实验室被支原体污染后，如果不进行有效彻底的支原体检测并清除，该实验的细胞培养很难进行下去，细胞传代3代以后状态就急剧下滑，无法进行正常实验，甚至需要更换细胞间。综合FDA、美国模式菌种收集中心(ATCC)等机构收到的相关数据，世界各国细胞系支原体污染的平均比例为30-60%[2]。一项来自宾夕法尼亚大学的研究显示，在NCBI的2012-2013年的GEO项目中，约11％含有支原体污染[3]，支原体污染已经成为细胞培养工作中最显著的问题之一。
支原体污染细胞的后果
支原体污染是个循序的过程，因其没有细胞壁，普通抗生素对其无效[4]。根据已发表的支原体污染研究文献，支原体污染细胞后，几乎能影响每一个细胞参数。其可能导致细胞染色体的异常和损伤，改变细胞的代谢、生长、形状、附着，甚至会影响到基因表达。此外，支原体污染能耗尽营养物，促进代谢积累，重度支原体污染还将导致培养基pH改变。
为了全面了解支原体污染情况，来自加州大学的John Hogenesch教授获得了九千多份样本的RNA测序数据，这些样本来自于2012年-2013年间哺乳动物细胞的基因表达研究[3]。John在测序数据中寻找支原体DNA，结果发现11%的样本都受到了支原体的污染。
据John表示，支原体DNA水平最高的一些研究，曾发表在Cell、Nature和PNAS等顶尖杂志上。虽然支原体污染并不一定意味着这些研究结果无效，但这种微生物会影响数百个基因的表达，并与细胞竞争营养阻碍细胞的生长。在其中一组淋巴瘤细胞受污染的数据中，John鉴定出了61个被支原体改变的基因。由此可见，支原体感染能在不知不觉中干扰研究结果，浪费大量的科研资金和宝贵的时间——John的实验室曾遇到过一次支原体污染，虽然问题很快得到解决，但仍然浪费了大约十万美元和一年的研究。
在细胞培养的各个环节，都容易受到支原体污染，比如操作人员的疏忽、培养基更换时操作不规范、细胞在实验室间流通时缺乏质控等，由于细胞受到支原体污染时形态不易发生变化，因此很难通过简单观察辨别细胞是否收到了污染，等到发现细胞感染了支原体时，已经为时已晚。
如何进行安全的无支原体细胞培养？先从这十大技巧记起吧！
一般来说，新的细胞株都需要做支原体检测，细胞培养期间，每1-2周建议进行一次支原体检测以防止污染。
最近十年里，有两种经典的方法被用于常规支原体检测，它们的灵敏度和可靠性已经获得了证实：培养法和指示细胞培养法。在过去几年里，支原体检测对速度快、灵敏度高且稳健性高的需求日益增加。在分子检测技术出现之前，传统的培养方法一直是微生物检测的金标准，迄今为止，全球范围内仍将它作为支原体常规检测方案。不同于培养法，指示细胞培养方法通过对培养物的DNA染色来判断是否存在支原体生长。可用于某些“挑剔”的支原体检测，因为这些支原体不能在用于培养方法的标准培养基中生长。除了以上两种药典认证的方法外，目前实验室常用的方法还有DNA荧光染色法、PCR扩增技术、环介导的等温扩增法等。通常需要一种操作简单，耗时较短，灵敏度较高，结构准确的方法以应对日常检测的需求，其中PCR扩增技术、环介导的等温扩增法以耗时短见长，而DNA荧光染色法和生长抑制试验因操作简单受到青睐，以下是各种方法的优势对比。以上列举的检测支原体方法各有优势，但是即便通常被认为是“金标准”的培养法，也可能会漏掉某些需要特殊培养条件的“精挑细选”的支原体。因此，在实验室的日常研究需求中，需要一种快速、全面的检测方法以应对日常的检测需求。支原体污染是生物制品外源因子污染检查的经典话题，生物源性原材料、采用细胞培养技术制备的疫苗、抗体、基因治疗产品在研发过程的不同阶段都需要进行支原体检测。此外，几乎涉及到细胞培养的研究也都需要防范支原体的污染，目前尚无一劳永逸地预防手段，这就要求在研发过程的各个环节中需要严格遵循操作规范，且由于支原体的隐蔽性较强，增加检测次数是性价比较高的预防手段。[1]赵翔,冯建平,孟淑芳.支原体检查的核酸检测方法及方法学验证的思考[J].中国药事,2018,32(08):1020-1027.DOI:10.16153/j.1002-7777.2018.08.003. [2]https://shcqsw.biomart.cn/news/3042010.htm[3]Callaway E. Contamination hits cell work. Nature. 2014 Jul 31;511(7511):518. doi: 10.1038/511518a. PMID: 25079533.[4]https://zhuanlan.zhihu.com/p/166220919[5]英聪. 应用PCR法检测生物制品中支原体污染[D].华中农业大学,2013.[6]李小静,练炳洲,邓月嫦,王凤国,梁榕丽.生物制品生产中支原体污染的检测和预防[J].山东畜牧兽医,2012,33(01):55-56.[7]朱庆虎,刘兰刚,康二勇.生物制品生产过程中支原体污染的预防和清除[J].畜牧兽医科技信息,2010(07):6-7.本文来源BioArt，版权归原作者所有，授权转载请联系原作者。文章只为学术新闻信息的传播，不代表本公众号观点。如有侵权请联系删除。
扫码关注我们
科学指南针一测试万事屋
干货丨资讯丨教程丨视频
课件丨文献下载丨测试服务