【eScience-干货】一文带你学习电子衍射和花样标定
目录
摘要
1. 透射电镜中的电子衍射
1.1 电子衍射的发现
1.2 透射电镜中电子衍射花样特征
1.3 电子衍射在纳米材料上的应用
1.4 电子衍射在生命科学领域的应用
2. 电子衍射原理
2.1 电子衍射花样的形成
2.2 晶带定理
3. 常见电子衍射花样及特征
3.1 单晶电子衍射花样及特征
3.2 多晶电子衍射花样及特征
3.3 非晶电子衍射花样及特征
4. 电子衍射标定
4.1单晶电子衍射标定
4.2多晶电子衍射标定
总结
参考文献
摘要
透射电镜中的电子衍射花样传达了晶体结构的重要信息， 解释这些电子衍射花样的含义，标定其中有关的晶体学参数对于我们进一步解析晶体结构十分重要。本文主要讲述了透射电镜中的电子衍射花样的特点，电子衍射的基本原理，对比常见的电子衍射花样及特征，并进一步说明单晶和多晶的电子衍射标定过程。
1．透射电镜中的电子衍射
1.1 电子衍射的发现
1927年，Davisson和Germe在观察镍单晶表面对能量为100电子伏的电子束进行散射时，发现了散射束强度随空间分布的不连续性，即晶体对电子的衍射现象。 这一著名的电子衍射实验证明了电子的波动性，并为建立电子衍射（Electron Diffraction，ED）这一新的学科开辟了道路。1939年，Kossel和Mollenstedt 认识到将电子衍射应用到透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM）中的可能性。经过近些年的不断发展，电子衍射已成为TEM中极为重要的一部分，电子衍射可与物相的形貌相结合进行分析，进而使电镜成为由表及里的分析仪器。
图1 Davisson（左）及其ED实验装置原理图（右）
1.2 透射电镜中电子衍射花样特征
1) 样品的结构信息和形貌可以一一对应进行分析。
2) 适用于分析晶体样品的微区和微相的晶体结构；分析范围的直径可小于50 nm。
3) 与X射线相比，X射线衍射得到的是样品的宏观平均信息，即样品的表层和内部信息不可区分。而电子衍射可以对样品的微区形貌和结构进行同位测量，且可以进行表层结构分析。
4) 易于测定晶体间的取向关系，测定孪晶、位错和层错的特征参数。
5) 电子衍射花样是晶体倒易点阵二维截面图像，简明直观，易于理解。
6) 电子衍射斑形状直接反映晶体形状、塑变、缺陷和应变场的特征。
1.3 电子衍射在纳米材料上的应用
纳米材料作为材料科学中的重要一员，以其特殊的物理化学性质和广阔的应用前景而受到越来越多的关注。而纳米材料的结构对其性质有很大的影响，因而对纳米材料而言，电子衍射是非常重要的技术手段。这主要是由于电子衍射在表征纳米材料的结构时具有以下特点：
1）灵敏度高，电子衍射可以对几纳米的晶体的结构进行解析，这是X-射线衍射技术无法做到的。例如，利用原位电子衍射技术观察锂/钠离子电池正极纳米材料在反应过程中的表面相变时，观察区域可以锁定在20nm以内。
2）电子衍射强度的不同可以区分二维材料的层数。例如对于AB型堆垛的石墨烯，在单层石墨烯的衍射图样中，形成最内层六边形的6个衍射斑点与次内层的6个衍射斑点强度大致相等(图2左)；在双层石墨烯的衍射图样中，次内层衍射斑点的强度明显强于内层（图2右）。
图2 单/双层石墨烯（ AB型堆垛）的电子衍射图样
3）确定纳米晶体的结构参数。在传统的电子衍射分析过程中，只能得到晶体结构二维的信息。同时由于衍衬动力学效应的存在，使得与结构相关的衍射斑点强度信息完全被多次衍射所掩盖。此外，一些本应消光的衍射斑点也会通过二次衍射的方式而显现出来，使得同一晶体结构的许多晶带轴甚至不同晶体的不同晶带轴的衍射花样变得极其相似而难以分辨。例如钙钛矿晶体的[110]，[101]与[011]晶带轴衍射花样除某些衍射斑点强度存在差异外，几乎完全一样（图3）。而在实际电子衍射分析时，这些强度差异肯定被掩盖，三个晶带轴的电子衍射也就无法区分。因此,要全面掌握复合钙钛矿的结构特征，特别是低对称性晶体结构特征，必须寻求新的结构分析手段来消除传统方法上的不足。
图3 衍衬运动学模拟计算正交结构钙钛矿晶体〈110〉系列晶带轴电子衍射花样
旋进电子衍射技术是近年来新发明的新型电子显微分析技术，可以在几个纳米到几百纳米电子束斑下，得到接近于其运动学强度的电子衍射花样。在旋进电子衍射工作模式下，通过倾斜样品，让晶体沿某一特定晶带轴旋转，获得一系列的电子衍射花样，即可得到多个晶带轴的倒易点阵，根据这些电子衍射花样和倾转角可以重构出三维的倒易点阵（即三维电子衍射），从而可以确定未知结构所属的晶系和晶胞参数。
在旋进电子衍射过程中，由于电子束与晶带轴不严格平行，可以避免最强的动力学效应，使电子衍射斑点强度接近运动学条件。而由于动力学效应的消除，旋进电子衍射花样斑点强度即为衍射束的积分强度。
1.4 电子衍射在生命科学领域的应用
生物大分子（如蛋白质和核酸等）作为结构生物学的重点研究对象之一，掌握其结构信息可以在分子水平上理解组织和细胞内发生的动态过程，进而帮助生物学家更好地认识生命活动的过程。由于生物样品在高能电子束辐照下极易损伤，因而只能在低电子剂量条件下进行成像。而传统TEM成像在低电子剂量条件下获得的图像面临衬度弱、信噪比低、低频缺失等亟待解决的问题。而冷冻或低温可以有效地缓解高能电子束对样品造成的辐照损伤，而且可以大幅降低样品的反应活性，提高样品的稳定性，于是冷冻电镜（Cryogenic Electron Microscopy，Cryo-EM）应运而生。
冷冻电镜是表征辐照敏感材料的有力工具，是解析生物样品结构的重要手段。相比较于传统的 X 射线晶体衍射的方法，其可以保护样本不受破坏。这种方法是采用高压液氮快速冷冻技术，使样品包埋在接近于生理状态下的玻璃态的水环境中，减少在制备过程中样品的结构被破坏的几率，进而观察到生物大分子的天然结构。同时因为是速冻，时间极快，这就有可能把生命活动的执行者-蛋白质在某一特定活动的某一特定的时间固定下来，再通过对其结构的观察就可以了解蛋白质在不同状态下的瞬时结构变化。然而，无论是何种成像技术，都只能拍摄二维照片，但是二维的图像早已无法满足生物大分子日益增长的研究需求。而冷冻电子显微镜单颗粒技术（Cryo-Electron Microscope Single Partical Analysis, cryo-EM SPA）可以实现小至血红蛋白尺寸大小的蛋白颗粒大至几百万道尔顿量级的蛋白质颗粒的三维成像。其三维重构的理论基础是一个物体的三维投影像的傅立叶变换等于该物体三维傅立叶变换中与该投影方向垂直的通过原点的截面（即中心截面）。每一幅电子显微像是物体的二维投影像，倾斜样品，沿不同投影方向拍摄一系列电子显微像，经傅立叶变换会得到一系列不同取向的截面，当截面足够多时，会得到傅立叶空间的三维信息，再经傅立叶反变换便能得到物体的三维结构（图4）。
图4 冷冻电镜三维重构的基本流程
冷冻电镜一般包括冷冻透射电子显微镜(Cryogenic Transmission Electron Microscopy，cryo-TEM)和冷冻聚焦离子束-扫描电子显微镜(Cryogenic Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscopy，cryo-FIB-SEM)。冷冻透射电子显微镜结合了冷冻技术和TEM较高的空间和能量分辨率，可以实现纳米甚至是原子尺度的成像。同时cryo-TEM也可以对微小的晶体(生物大分子、化学小分子、天然产物等)进行衍射即微晶电子衍射(Microcrystal Electron Diffraction，MicroED)，然后收集电子衍射数据从而对生物大分子进行结构解析。此外MicroED也可与冷冻聚焦离子束技术相结合，可以将尺寸稍大但仍不适用于X射线晶体学的晶体减薄，将适用于MicroED的晶体尺寸范围扩大至几十微米，大大拓宽了MicroED技术的应用范围，填补了MicroED和X射线晶体学之间的空隙。
2．电子衍射原理
2.1 电子衍射花样的形成
衍射花样相当于倒易点阵被反射球所截的二维倒易面的放大投影（图 5）。
1) 当波长为λ的单色平面电子波以入射角θ照射到晶面间距为d的平行晶面组时，各个晶面的散射波干涉加强的条件满足布拉格方程：2dsinθ =nλ。
2) 入射电子束照射到晶体上，一部分透射出去，一部分使晶面间距为d的晶面发生衍射，产生衍射束。
3) 采用薄晶样品时，样品倒易阵点会沿厚度方向延伸成杆状，增加了与爱瓦尔德（Ewald）球的交截机会，使略偏离布拉格方程的电子束也能发生衍射。
图5 电子衍射花样形成示意图. L：相机长度，λ：电子波长（Lλ: 相机常数）
R：衍射斑距透射斑长度，d: 衍射斑对应的晶面间距
2.1.1 电子衍射的几何公式及相机常数
衍射花样的投影距离：R=Ltan2θ，当θ很小时，tan2θ=2θ，sinθ=θ
联立布拉格方程2dsinθ=λ得到：Rd=Lλ=相机常数。
2.1.2 Ewald球
Ewald衍射球：以晶体点阵原点O为圆心，以1/λ为半径作一圆球面，称为Ewald衍射球。
从O作入射波波矢k（该矢量平行于入射束方向，长度等于波长的倒数，即 k=1/λ），其端点O*为相应的倒易点阵的原点。若有倒易阵点G（hkl）正好落在Ewald衍射球的球面上，则相应的晶面组（hkl）与入射束的位向必满足布拉格条件，而衍射束的方向就是OG或者衍射波矢量k’，其长度等于反射球的半径（图6）。
图6 Ewald衍射球图解法示意图
说明：布拉格公式是衍射几何条件在正空间中的表示法，Ewald球构图则是对衍射几何条件在倒易空间中的描述。
2.2 晶带定理
晶带定理：凡属于[uvw]晶带的晶面其晶面指数（hkl）必满足以下关系：hu+kv+lw=0。
1) 晶体中，与某一晶向[uvw]平行的所有晶面（hkl）属于同一晶带，称为[uvw]晶带，该晶向[uvw]称为此晶带的晶带轴（图7）。
2) 根据晶带定理，可以由任意两个晶面（h1k1l1）（h2k2l2）计算出相应晶带轴，计算方法如图8：
图7 晶带正空间与倒空间对应关系图
U=k1l2-k2l1，V=l1h2-l2h1，W=h1k2-h2k1
图8 晶带轴计算方法说明
3. 常见电子衍射花样及特征
3.1 单晶电子衍射花样及特征
当一电子束照射在单晶体薄膜上时，透射束穿过薄膜到达感光相纸上形成中间亮斑；衍射束则偏离透射束形成有规则的衍射斑点（图9 左）。
特征：明锐的衍射斑点，靠近透射电子束的衍射斑点有较高的强度，外侧衍射束的强度逐渐降低；衍射斑点的间距与晶面距离的倒数成正比；衍射斑点形成规则的几何形状（二维网格），且衍射斑点的几何形状与二维倒易点阵平面上倒易阵点的分布是相同的；电子衍射图的对称性可以用一个二维倒易点阵平面的对称性加以解释；改变晶体取向会引起倒易阵点与反射球面交截情况变化，从而导致电子衍射束的强度、数目以及对称性都发生明显变化，因为晶体取向的变化改变了衍射条件。
3.2 多晶电子衍射花样及特征
对于多晶体而言，由于晶粒数目极大且晶面位向在空间任意分布，多晶体的倒易点阵将变成倒易球。倒易球与爱瓦尔德球相交后在相纸上的投影将成为一个个同心圆（图9 中）。
特征：半径恒定的同心圆环衍射线；同心圆环的半径依赖于点阵晶面间距；这些同心圆环衍射线的形状与入射电子束的方向无关。
3.3 非晶电子衍射花样及特征
非晶态结构物质的特点是原子的分布在非常小的范围内有一定的序，即每个原子的近邻原子的排列仍具有一定的规律，呈现一定的几何特征。原子排列的短程有序使得许多非晶态材料中仍然较好地保留着相应晶态结构中所存在的近邻配位情况，可以形成具有确定配位数和一定大小的原子团，如四面体，八面体或其他多面体单元。但不再具有平移周期性，因此也不再有点阵和单胞。
特征：🔺非晶态材料中原子团形成的这些多面体在空间的取向是随机分布的。由于单个原子团或多面体中的原子只有近邻关系，反映到倒空间也只有对应这种原子近邻距离的一或两个倒易球面。衍射球面与它们相交得到的轨迹都是一或两个半径恒定的，并且以倒易点阵原点为中心的同心圆环（图9 右）。
🔺由于单个原子团或多面体的尺度非常小，其中包含的原子数目非常少。所以，非晶态材料的电子衍射花样只含有一个或两个非常弥散的衍射环。
🔺非晶态物质的结构呈近邻有序，长程无序态，没有任何周期性结构可言。通常用原子径向分布函数(原子周围的配位原子沿径向的统计分布)来描述其结构。
图9 不同晶体结构的衍射花样
4．电子衍射标定
4.1 单晶电子衍射标定
4.1.1 已知晶体结构，单晶电子衍射花样的标定
🔷 准备工作
1）Reci软件的安装。（说明：该软件只能在32位电脑上运行）
2）寻找并获取CIF文件：CIF文件一般可通过网站http://www.crystallography.net/获取。通过CIF文件观察其晶格常数a，b，c，及其夹角、空间群、晶格类型。这里我们以LiNiO2 单晶的标定为例。（LiNiO2 由于比容量高、成本低、对环境友好而成为下一代锂离子电池极具前景的正极材料）
3）DigitalMicrograph软件的安装：软件下载网址：https://www.gatan.com/products/tem-analysis/gatan-microscopy-suite-software。
🔷 Reci软件操作过程：
1) 双击打开软件，在Title处输入样品名，回车；
2) 依次输入样品晶格常数a, b, c，以及对应的ɑ，β，γ角度，回车（图10）；
图10 Reci软件操作过程示意图（以LiNiO2为例）
3) 依次输入样品晶带轴最大值，晶系（1是立方；2是四方；3是正交；4是六方；5是单斜；6是三斜），点阵类型（1是面心格子；2是体心格子；3-5是底心格子；6是简单格子；7是三方晶系格子），回车（图11）；
（说明：晶带轴最大值指的是[uvw]中最大的一个值，例如[879]带轴中的最大值为9，一般样品晶带轴的最大值不超过12，若是不确定样品晶带轴最大值，可输入12。晶系和空间群可直接在cif文件上读出。）
图11 Reci软件操作过程示意图（以LiNiO2为例）
4) 输入误差值，一般为0.1或0.01，回车；
5) 输入文件名，回车，得到标准的LiNiO2 text文件，此text文件一般默认自动存在Reci软件文件夹下（图12-13）。
图12 Reci软件操作过程示意图（以LiNiO2为例）
图13 text文件（LiNiO2）
🔷 图像的处理
1) 确定透射斑点O的位置（任意两对对称点连线的交点），选择衍射斑A、B，使R1和R2为最短和次短长度，测量R1、R2和夹角值，并计算R2/R1。（说明：该过程既可在PPT里完成，也可在DigitalMicrograph软件里进行）
2) 与标准图谱，即从Reci软件输出的text数据对比即可。
图14 LiNiO2的[001]晶带轴
如上图，测得R2/R1=1, ɑ=60.06°，经与标准图谱text（图10）对比，即为LiNiO2的[001]晶带轴，衍射斑A和B对应的晶面间距均为1.451Å（图 14）。
4.1.2 晶体结构未知，进行物相鉴定
1) 测定低指数斑点的R值。应在几个不同的方位摄取衍射花样，保证能测出最前面的8个R值。
2) 根据R，计算出各个对应的d值。
3) 查标准卡片和各d值都相符的物相即为待测的晶体。
注意：电子衍射的精度有限，有可能出现几张卡片上d值均和测定的d值相近，此时，应根据待测晶体的其它信息，例如化学成分等来排除不可能出现的物相。
4.2 多晶电子衍射标定
🔷 准备过程：安装DigitalMicrograph软件和Difftools插件，软件和插件的下载网址均为：https://www.gatan.com/products/tem-analysis/gatan-microscopy-suite-software.
🔷 DigitalMicrograph软件操作过程：
第一步：双击打开软件，导入要分析的多晶样品图片；(图片格式不限，若不是DM3格式，可先在DigitalMicrograph软件里面转成DM3格式)
第二步：找透射斑中心：打开Difftools插件，单击locate SADP Centre, 在出现的SADP Centre窗口里面，点击get image, 会出现红点，即为透射斑中心， 移动透射斑中心至合适的位置。然后单击manual手动确认透射斑位置，在出现的对话框里面点击proceed前往；（分为4步，具体如图15 ）
图15 DigitalMicrograph软件操作过程示意图
第三步：积分得到谱图：打开Difftools插件，单击Rotational Average, 在出现的Rotational Average窗口里面，点击get SADP, 会出现积分箭头，通过更改箭头的长度和角度来调节积分范围。然后单击Rot. Ave. 即可出现谱图；（分为4步，如图16-17）
（说明：多晶衍射中，每个衍射环对应一个晶面；积分谱图中最高的一个峰表示的是透射斑的位置，其他每个峰均表示晶体结构的晶面 ）
图16 DigitalMicrograph软件操作过程示意图
图17 DigitalMicrograph软件操作过程示意图
第四步：确认晶面。可在谱图上直接进行测量并算出晶面间距d值，和标准卡进行对比，进而确认晶面（图18）。
图18 DigitalMicrograph软件操作过程示意图
总结
电子衍射作为透射电子显微镜中重要的一部分，主要用于研究晶体结构、缺陷等。电子衍射花样常常与对应样品的形貌联合分析，进而得到样品的晶体结构、点阵常数、样品形状等信息。随着科技的不断发展，图像计算、处理和传递的速度和精确度的提高，电子衍射花样愈发反映样品真实的结构特征，这对于从原子尺度揭示材料的结构具有重要意义。
参考文献
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