端粒、线粒体和炎症是衰老的三个标志。事实上,这三个标志常被单独研究,每一个单拎出来都是国自然申报的热点。那么,如果将这三个标志“强强”联合起来共同研究,又会碰撞出什么样的火花?今天,梅斯学术将以这篇Nature文章为例,为大家介绍“强强联手斩获顶刊”的方法。一、背景介绍癌症是通过遗传和表观遗传改变的积累而引起的,这些改变使细胞能够逃避基于端粒的增殖障碍(复制性衰老和危机),从而实现永生。衰老是p53和RB依赖性的,通常会在缩短的端粒引起DNA损伤反应时发生。危机是一种自噬依赖性程序,可消除具有不稳定端粒和其他癌症相关染色体畸变的检查点缺陷细胞。此外,危机为复制性衰老提供了一种冗余的肿瘤抑制机制,cGAS-STING信号触发一种非经典形式的自噬,能够执行细胞死亡而不是维持细胞存活。尽管这一发现确立了危机中细胞死亡期间自噬的重要作用,但尚不清楚功能失调的端粒如何激活细胞死亡所需的先天免疫信号通路。二、研究内容与套路1、ZBP1在危机中介导先天免疫反应,ZBP1信号激活需要Zα2和RHIM1结构域为了研究危机,研究者对肺成纤维细胞的p53和RB肿瘤抑制通路进行了沉默或破坏,并测序了RNA,发现危机过程主要与先天免疫和炎症有关。之后,进行CRISPR-Cas9敲除正向筛选,富集分析发现先天免疫传感器ZBP1(也称为DAI和DLM-1)与CGAS–STING–IFN通路。建立在前人研究上:ZBP1可诱导I型IFNs并调节先天免疫和细胞死亡。研究者通过敲除或构建突变体形式的ZBP1,探究ZBP1的哪些结构域在危机期间对信号传导至关重要,发现ZBP1(S)以依赖自噬和I型IFN活性的方式驱动细胞死亡,ZBP1介导的转导信号需要Zα2和RHIM1结构域。这些结果直接将ZBP1与危机期间的先天免疫激活和细胞死亡联系起来。研究套路:为研究危机,研究者构建了危机模型细胞系。为了寻找哪些基因是危机产生的基础,作者使用正向选择CRISPR-Cas9基因敲除筛选,发现了ZBP1。危机产生过程主要与先天免疫和炎症有关,如ISG等;于是,研究者敲除了ZBP1后,废除ISG特征,证实危机期间ISG的诱导归因于ZBP1,明确了ZBP1与先天免疫和炎症的联系。下一步便是明确ZBP1的哪些结构域在危机期间对信号传导至关重要,逐渐缩小研究范围。2、端粒功能障碍是ZBP1依赖性IFN信号传导所必需的危机是一个依赖端粒的程序,研究者敲除了IMR90E6E7细胞中的端粒保护因子TRF2,观察到ZBP1(S)上调和通过TBK1磷酸化的I型IFN反应,证实了ZBP1缺失抑制TBK1-IRF3信号传导,降低了ISG表达并减弱了自噬,但不影响端粒融合,而在永生化细胞中ZBP1缺失或不表达。研究进一步发现,ZBP1(S)仅在具有短端粒的前复制危机细胞中表达时才增强IFN反应,这表明ZBP1(S)需要额外的针对端粒功能障碍的特异性免疫刺激分子。总之,在危机中启动ZBP1依赖性IFN反应需要两个刺激:①