学习说 | MCAO模型稳定的关键
什么是MCAO模型呢？
又名大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion），是一种局灶性脑缺血模型，目前应用最广泛的脑缺血模型。其组织病理和行为变化与人类缺血性脑卒中表现相似。
背景小贴士：脑血管疾病是世界上严重危害人类健康的三大疾病之一，发病率已达到76.1-144.6/10万万。死亡率可达56．6％～80％ ，即使存活，也留有严重的后遗症影响生活质量。其中缺血性脑血管病居多，大部分由大脑中动脉梗塞（MCAO）引起。 因此建立一种生理指标控制严格、操作简便、稳定可靠且重复性好、与人类脑缺血病理过程相似的理想脑缺血动物模型，对脑缺血病理机制和药物的研究至关重要。
制备MCAO模型的方法
包括光化学法、三氯化铁法、线栓法、自体血栓法、电流损伤法及自发性MCAO法等。由于Zea Longa线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间等方面的优点，对研究神经元对缺血的敏感性与耐受性、药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗等方面较为理想，是目前应用最广泛的脑缺血动物模型方法。
下面我们主要谈谈线栓法制备局灶性脑缺血模型稳定的关键。
关键一 线栓的选择和处理方式
MCAO线栓（MCAO Monofilaments, MCAO Sutures）则是制备大鼠、小鼠（或其它实验动物）这一模型非常关键的实验材料，如何选择合适的栓线，包括栓线的种类、直径、插入深度、头端处理方法等都是非常关键的。
线栓种类一般分五个级别，每个级别分为若干型号和规格，其中包被硅胶的是最好的线栓，实验稳定均一性好：
A1级：头端无包被、无标记、无消毒，需要用户自己消毒、标记；
A2级：头端无包被、有标记*、已消毒，如用户不需包被可以不需任何处理直接使用；
A3级：头端包被多聚赖氨酸#、无标记、已消毒、需要用户自己做标记；
A4级：头端包被多聚赖氨酸#、有标记*、已消毒、即买即用型，不需做任何处理；
A5级：头端包被硅橡胶，有标记*已消毒，即买即用型，不需任何处理。
研究表明(Tsuchiya et al. 2003)，无包被的圆头线栓在 MCAO实验过程中可能导致高达40%的蛛网膜下腔出血，而其标准差可能比平均值的50%还要大。另一项技术文章表明(Shimamura et al. 2006a)，硅胶包被线栓要远好于无包被的圆头线栓，其结果更为稳定，即使对于没有经验的实验者来说也是如此。而多聚赖氨酸包被的线拴只能增加死亡率，不能减少梗塞体积的变异程度(Huang et al. 1998)。
常用的栓线：主要由尼龙线、进口钓鱼线。根据Longa法 和Koizumi法，大鼠采用4-0尼龙线，小鼠采用6-0尼龙线。
成功的MCAO模型的脑血流在插入线拴时会有断崖式下降；在拔出线拴后，激光散斑血流检测的血流会很快恢复（图A）。采用硬质栓线，极易戳破血管，造成蛛网膜下腔出血（Subarachnoidhemorrhage，图B）。手术过程中血管如果被线栓戳破，脑血流不会有断崖式下降，而是缓慢下降；在拔出线栓后，脑血流也不会恢复。
瑞沃德线栓采用柔韧度非常好的进口单丝尼龙线，经显微操作，头端均匀包被硅胶，其表面光滑，粗细一致，易进入颅内又不至于刺破血管，使用本产品可大大提高模型制备的成功率，及脑缺血范围的稳定性。
产品特点/优势
本产品头部采用质地软的硅胶来增粗直径但不增加硬度，既可以达到完全堵死血管，又保证模型制作成功，极大提高了模型的稳定性；
具有明显的指示点：使用时，由于本栓线质地柔软，所以，当插到位置后能明显感到阻力，并同时看到血管绷直、线栓弯曲，此时，停止插线。如果初次制作，无法感到阻力，可根据本产品给定的标记点来插线（如上图）；
C.本产品已经过紫外灭菌，打开包装即可直接使用，并且可根据客户的特殊要求实行定制。
硅胶包被长度：包被的硅胶长度不同，形成的梗死面积不一样，为了保证结果均一性、防止假阳性/阴性结果，需统一包被硅胶长度，不同的包被长度形成不同的梗死面积如图：
使用自制的硅胶包被的线栓，大鼠(Schmid-Elsaesseret al. 1998)及小鼠(Shah et al. 2006)的脑梗塞体积的标准差均在30%左右。而使用质地较好MCAO线栓可以得到更好的结果，有些MCAO线栓结果的标准差可达10%-20%。
插线的深度：插线的深度一般从颈动脉交叉处开始计算。如小鼠一般插入深度为0.5—0.9cm，大鼠插入深度一般17—18mm。由于动物个体存在差异及体重的影响。多数学者强调，在插线时手下感觉有阻力时必须停止插入，否则会导致SAH。
关键二 动物的选择
目前可适用于线栓MCAO的动物种类很多，包括啮齿类、兔、狗、猴等，因啮齿类价廉易于购买，脑体积适中，非常适合于病理生理、免疫组化、分子生物学等的研究，目前最常用。
鼠种的选择：不同的品种大鼠在阻断MCA后脑梗死面积(体积)的大小和恒定性不同。Wistar大鼠MCAO平均脑梗死体积最小，梗死灶变异最大；Fischer2 334大鼠梗死灶最大，变异最小；而SD大鼠介于两者之间。Wistar大鼠衍生的脑卒中倾向大鼠(SHRSP)阻塞远端MAC引起的梗死体积最大。SD大鼠与Wistar大鼠相比，手术中出血少，操作更容易。
性别的选择：多数学者认为，雌激素对脑损伤有保护作用，不主张雌雄混用，多选用雄性动物。
鼠龄的选择：由于脑血管病多见于老年人，故理论上动物模型也应选择老龄大鼠。有研究者发现：Wistar大鼠衰老后MCA管腔增大，厚度随增龄而减小，内膜的变化主要表现为基膜增厚、内弹性膜厚薄不一、断裂或分层等。老年大鼠的MCA发生了不同程度的迂曲、粥样硬化、管腔狭窄等解剖病理上的改变，因此不宜盲目选用老年大鼠，除非特别需求，鼠龄的选择以青年健壮为宜。
体重的选择：动物的血管粗细与体重密切相关。为获得较一致的缺血灶，宜选择体重差异小的鼠为宜。大鼠体重250—300 g，小鼠25-30g的最佳。目前，大多数研究者都选用此范围。
关键三 麻醉剂的选择
麻醉剂对脑缺血的影响很大，常用的麻醉剂有水合氯醛、戊巴比妥钠、苯巴比妥钠、乌拉坦等。10％水合氯醛麻醉效果好，动物苏醒快，但抑制心肌收缩，心律失常；巴比妥类对脑缺氧有保护作用，在进行脑缺血研究时，一般不用。国外学者制作该模型时多采用氟烷诱导麻醉，行机械通气维持吸入麻醉，麻醉稳定、安全、手术成功率高，获得广泛的实验者喜爱。
瑞沃德拥有单通道、多通道、桌面式、移动式、通用型、灵动型等动物麻醉机各种款式的产品系列。可满足大鼠、小鼠、猫、兔、狗、猴、猪、鸟、蛇、鸡、乌龟等不同种类、不同体重动物手术的麻醉需求。产品质量和性能均超过国际标准。已经销往全球80多个国家。并且拥有不同的麻醉解决方案，满足不同的实验需求，如：
* 多功能解决方案-- 用于脑缺血&心肌缺血模型制作、尾静脉注射等应用；
* 神经系统解决方案-- 用于神经系统疾病模型的制作，如帕金森（如下图）；
* 麻醉&呼吸配套解决方案-- 用于呼吸功能障碍疾病模型，如开胸手术。
关键四 手术操作
MCAO模型的制作对动物手术要求很高，包括切口的选择，血管的分离和暴露，手术的时间等等都影响模型的成功。下面列举了术中操作要点：
操作过程中需要有一热源给动物提供温热环境
通过捏两个后脚趾或尾巴测试麻醉深度
监测动物的生命体征，如血糖、血压、呼吸模式、皮肤/粘膜颜色和麻醉深度
对灭菌后手术器材及手套能在同一手术操作重复使用
使用无菌器械时应使其尽量保持在无菌环境中
采用合适的方法和材料缝合伤口
手术中实验操作及术后的护理要正确
关键五 血流监测评价的模型的是否成功的金标准
造模成功与否的标志需要术后模型进行一系列的评价，包裹偏瘫、Homor征、追尾征、神经功能评、TTC染色组织形态学检查、MR影像学检查等各种评价，其中激光散斑血流成像(Laser Speckle Flowgraphy,LSFG)技术采用了生物医学领域血流变化监测的一种无需扫描全场光学成像方法，与其它技术相比具有一些独到的优点，具有非接触、无创伤、快速成像等优点。此技术非常适用于血液微循环的测量，使用激光散斑技术可以测量血管管径、血管密度、血液流速和血流灌注等微循环参数，其有效性已经在近10年中被众多的临床实例所证明。
激光散斑成像近10年来发展的新技术，具备激光多普勒不具备的优势：
A.能够对整个大脑的血流进行一次成像，检测多根血管缺血、再灌注和侧枝开放的情况
B.具有较高的空间分辨率和时间分辨率
C.仪器操作方便简单，可适用于包括大鼠、小鼠等多种动物脑血流的检测
D.对脑血流能够进行多个时间点的实时成像（术前、术中以及术后）
瑞沃德RFLSIPro+新一代激光散斑血流成像仪（如下图），基于全新的LSCI整体化技术设计，以独有的高时间和空间分辨率、全场快速光学成像的技术优势，为生命科学基础研究及临床医疗提供了一种实时动态血流监测和视频成像记录手段，时间分辨率可达毫秒量级，空间分辨率可达微米量级，实现了科研人员及医疗实时观察微血管的血流分布状态及血流数值相对变化的功能需求。
RFLSIPro+新一代激光散斑血流成像仪
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