T细胞特征与黑色素瘤患者免疫抑制治疗的毒副反应相关

研究背景

免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitors，ICIs）的出现，彻底改变了癌症治疗领域，让一些癌症患者获得了远超预期的临床疗效。但同时，因其独特的作用机制，免疫治疗也有其独特的不良反应——免疫相关毒副反应（Immune-related adverse events，irAEs），会影响一系列器官系统，包括肺、肝、心脏、皮肤、脑和胃肠道等，毒副反应的发生率与使用的免疫疗法相关。

目前约有10-60%接受免疫检查点抑制剂治疗的黑色素瘤患者，出现了较为严重的免疫相关毒副反应。然而，在临床实践中尚未明确哪类患者发生免疫相关毒副反应的风险最高，确定其致病因素仍具挑战性。

方法流程

为了探索黑色素瘤患者在进行ICIs治疗时产生毒副反应的原因，作者系统评估了71例转移性黑色素瘤患者在接受ICIs治疗前后的免疫特征，其中33名患者接受了抗PD-1治疗，38名患者接受了抗PD-1和抗CTLA-4的双免疫联合治疗，所有患者分为3组实验队伍：①irAEs分析组（n=18）；②irAEs训练组（n=26）；③irAEs验证组（n=27）。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）、Bulk RNA测序和质谱流式细胞术（Mass Cytometry）等手段，对黑色素瘤患者的外周血样本（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）进行深入分析，结合临床治疗后，各患者产生免疫相关毒副反应的严重程度，探索与毒副反应发展有关的免疫细胞特征。

实验流程示意

研究结果

1) CD4效应记忆T细胞的水平，影响免疫相关毒副反应的发展

首先对irAEs分析组18名患者的治疗前PBMC样本进行分析，其中8例患者在ICIs治疗后出现严重的毒副反应（irAEs等级为3级，图1a），CyTOF分析显示，CD4效应记忆T细胞（CD4 effector memory T cells，T_EM）的细胞水平可能影响毒副反应的发展（图1b-d）。

为了验证这一观点，对其中13名患者的PBMC样本（n=24807 cells）进行了scRNA-seq研究，采用无监督聚类方法，我们在7种细胞类型中识别出了32种细胞转录状态（图2a-b）。并计算了各转录状态下细胞丰度与严重毒副反应之间的关系，发现CD4 T细胞（state 3+state 5）与严重毒副反应的相关性最强。5种转录状态的CD4 T细胞的基因表达差异分析显示，CD4 T state 3和CD4 T state 5同时上调活化效应记忆T细胞的marker（HLA-DRA、MKI67、TNFRSF4、CCL5和IL32），下调中央记忆细胞（Central memory T cells，T_CM，SELL和CD62L）和Naive T细胞（CCR7和TCF7）的marker（图2c-d）。此外，根据活化marker（HLA-DX和MKI67）将这2种状态的CD4 T细胞细分为活化亚群和静息亚群时，活化亚群与严重的毒副反应之间表现出最强的相关性，表明活化状态下的CD4 T_EM细胞可能导致ICIs治疗产生严重不良反应。

图1 使用Mass cytometry分析检测严重irAEs状态的细胞决定因素图2 使用single-cell RNA-seq分析检测严重irAEs状态的细胞决定因素

2) 活化CD4记忆T细胞水平和TCR克隆型的多样性预示着严重的irAEs发展

接着，作者对53例转移性黑色素瘤患者的治疗前PBMC样本进行了Bulk RNA-seq，这53例患者包括2组实验队伍，即irAEs训练组（n=26）和irAEs验证组（n=27），对这些患者使用抗PD-1检查点阻断治疗方案（n=29）或抗PD-1和抗CTLA-4的双免疫联合检查点阻断治疗方案（n=24）。

在评估转录组的循环免疫学特征时发现，只有活化CD4记忆T细胞的细胞水平与严重的irAEs发育相关（图3a），而且在Bulk RNA-seq的PBMC样本中，显示出“较高的TCR克隆型多样性预示着严重的irAEs发展”这一特点（图3b）。此外，作者建立了一组综合活化CD4记忆T细胞丰度和TCR多样性2种特征的复合模型，经过训练和验证计算，作者认为该模型具备可以独立于检查点阻断治疗类型、患者年龄、患者性别和其他临床参数而预测患者发生严重的irAEs的时间，同时也强调了irAEs发展的生物学特异性（图3c-e）。

图3 irAEs检测的综合建模

3) TCR克隆扩增的程度与严重的免疫相关毒副反应相关

临床报告显示，发生过严重免疫毒副反应的黑色素瘤患者，其受影响的组织中存在克隆扩张的自身反应性T细胞或病毒反应性T细胞^[1-2]。因此，作者认为在ICIs治疗后发展为严重irAEs的患者中，其治疗前PBMC的TCR克隆型会表现出更大的扩张倾向。

对15例接受双免疫联合治疗患者的PBMC样本进行的TCR-ß分析发现，与未发生严重irAEs的患者相比，严重irAEs患者的TCR克隆扩张的现象更为显著（图4a)。在同时进行了scRNA-seq和scTCR-seq的严重irAEs患者（n=3）中发现，治疗前后2种PBMC样本中检测到的克隆中，活化的CD4 T_EM优先扩张，且persistent CD4 T细胞克隆在state 3和state 5这2种CD4 T细胞群体中高度富集（图4b）。此外，在接受双免疫联合治疗的患者中，T细胞早期的克隆扩张和严重irAEs的发病时间也具有显著的相关性（图4c）。

图4 双免疫联合治疗患者中，发生严重的irAEs的相关因素

4) 严重的免疫相关毒副反应可能体现了自身免疫性疾病的潜伏状态

最后，作者应用CIBERSORTx技术，对587名自身免疫性疾病患者（患有系统性红斑痤疮 Systemic lupus erythematosus，SLE 或肠炎 Inflammatory bowel disease，IBD）和191名健康个体的PBMC样本进行综合分析。在检测的细胞亚群中，循环活化的CD4记忆T细胞与自身免疫性疾病的关联最为显著（图5）。这表明，严重的irAEs可能表示着一种潜在的自身免疫性疾病状态，在接受ICIs治疗后，其临床症状才被体现出来。

图5 关于自身免疫性疾病的大数据评估

结论

本研究证实了活化CD4效应记忆T细胞的细胞水平和TCR克隆的多样性，可以有效地预测转移性黑色素瘤患者在ICIs治疗后诱导产生免疫治疗毒副反应的严重程度。在接受双免疫联合治疗的患者中，T细胞早期的克隆扩张和严重irAEs的发病时间也具有显著的相关性。此外，研究发现存在自身免疫性疾病的患者可能会因其体内较高的活化CD4记忆T细胞水平，而在ICIs治疗中存在更高的毒副反应发病率。但该研究组中所有患者均无自身免疫性疾病的记录，未来的研究中也需要进一步确定循环活化的CD4记忆T细胞，是否在严重irAEs的患者中表现出识别自身抗原的倾向性增加，以明确在ICIs治疗过程中的识别作用，这些发现可以促进改善免疫检查点封锁的风险情况，并对预测ICIs治疗诱导的毒副反应提供了可靠的方案，有助于改善高危患者的临床预后情况。

参考文献

[1] Johnson, D. B. et al. Fulminant myocarditis with combination immune checkpoint blockade. N. Engl. J. Med. 375, 1749–1755 (2016).

[2] Johnson, D. B. et al. A case report of clonal EBV-like memory CD4⁺T cell activation in fatal checkpoint inhibitor-induced encephalitis. Nat. Med. 25, 1243–1250 (2019).

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