单细胞RNA测序揭示了小鼠脊髓小胶质细胞对周围神经损伤的时间和性别特异性反应，并将ApoE与慢性疼痛联系起来
研究背景
小胶质细胞(microglia)是神经胶质细胞的一种，是中枢神经系统(CNS)中最主要的一道免疫防线。无数临床上和神经病理学研究表明激活的小胶质细胞在神经退化类疾病的发病机理中起到十分重要的作用。但是过多激活或失控的小胶质细胞会引起神经毒性。
单细胞转录组学技术的进展促进了对不同生理和病理过程中小胶质细胞异质性的研究，揭示了大脑中的小胶质细胞以多种转录状态存在，这些转录状态针对不同的发育阶段、解剖区域和病理学。然而，小鼠和人类脊髓中小胶质细胞的异质性尚不明确。尽管小胶质细胞在神经病理性疼痛的发展和维持中起着核心作用，但目前尚不清楚周围神经损伤是否会导致产生独特的小胶质细胞转录状态，从而促进并保持对疼痛的超敏反应。
方法流程
图1 方法流程示意图
作者使用单细胞RNA测序来定义小鼠和人类脊髓小胶质细胞的转录状态。作者采集了两名女性（53岁和68岁）和一名男性（39岁）的人类脊髓样本中单细胞水平的小胶质细胞。脊髓组织是通过快速尸检器官捐赠者程序从没有慢性疼痛或神经系统疾病记录的个体获得的。使用单细胞高通量液滴测序方法分离和处理脊髓组织，然后在硅片中分离小胶质细胞，共捕获到3823个细胞。在小鼠中，作者采集未经处理的、假手术组和SNI（spared nerve injury）小鼠（每个条件两个重复，每个重复4个小鼠；SNI和假手术进行双侧以避免同侧解剖）的腰脊髓分离小胶质细胞，捕获到小鼠的两性细胞共188787个（中值基因数：1900）。
研究结果
1.神经病理性疼痛中的小胶质细胞单细胞转录景观
作者研究了遭受神经病理性疼痛的备用神经损伤（SNI）测定的小鼠脊髓中的小胶质细胞。收集并分析了SNI后第3天（代表急性疼痛发展阶段）、第14天（超敏反应完全建立）和第5个月（双侧）（研究神经病理性疼痛的慢性期）的两性小鼠的腰脊髓中的单个小胶质细胞。使用基于液滴的10×Genomics Chromium系统处理纯化的小胶质细胞，从188787个测序的小胶质细胞生成高质量的单细胞转录组数据。对所有条件下的所有细胞进行无监督聚类分析，发现11个不同的簇。所有簇中的细胞都表达典型的小胶质细胞基因。
图2 神经病理性疼痛中的小胶质细胞单细胞转录景观
2.脊髓小胶质细胞转录状态的异质性
基因表达分析确定了在簇4、簇5、簇6、簇7、簇8、簇10和簇11中小胶质细胞中唯一表达的基因。簇9中的小胶质细胞表现出转录特征，在SNI后3天，雄性小鼠的小胶质细胞数量显著增加，而雌性小鼠的没有增加。在SNI第14天和第5个月，在两性中，属于簇9的小胶质细胞基本上未被检测到，这表明它们是由神经损伤引起的急性发作和雄性特异性起源。簇10代表了血管相关的小胶质细胞。簇11是巨噬细胞/单核细胞标记物的独特表达。
图3-1 簇中小胶质细胞中唯一表达的基因
图3-2 簇9中的小胶质细胞表现出转录特征
图3-3 周围神经损伤引起特定小胶质细胞亚群比例的变化
3.周围神经损伤导致雄性的小胶质细胞增殖大于雌性
SNI后三天，第7组和第8组中的小胶质细胞数量显著增加。但雌性的增长幅度较小，表明雌性小胶质细胞增殖减弱。为了证实这一发现，作者使用增殖细胞标记物Ki67标记增殖小胶质细胞，与小胶质细胞标记物Iba1共同染色。脊髓背角Ki67阳性小胶质细胞的定量分析表明，在SNI后第3天，雄性的增殖小胶质细胞数量显著高于雌性，证实了scRNA-seq结果。值得注意的是，雄性和雌性小鼠之间的小胶质细胞总数没有变化，这表明其他机制补偿了雌性小鼠的增殖减少。
图4 周围神经损伤导致雄性的小胶质细胞增殖大于雌性
4.周围神经损伤导致小胶质细胞转录组发生深刻的性别特异性变化
作者确定差异表达基因（DEG）来研究周围神经损伤后小胶质细胞的转录变化。通过比较两性之间的DEGs研究男性和女性小胶质细胞对周围神经损伤反应的差异。在SNI后第3天，雄性小胶质细胞比雌性小胶质细胞显示出更多的DEG，并且在每个时间点，两性之间只共享一小部分DEG。在第3天的前六个簇（1-6）中，雄性和雌性小胶质细胞中的DEG之间显示无相关性或负相关性，在随后的时间，雄性和雌性的DEG变化按聚类显示出弱到中度的正相关。此外，作者发现，在SNI后第3天，MAPK特异性磷酸酶Dusp1和Dusp6在簇3、8和9中在雄性小胶质细胞中选择性下调，但在雌性小胶质细胞中没有。
图5 周围神经损伤后小胶质细胞基因表达的变化
5. 在神经病理性疼痛的慢性期，小胶质细胞中ApoE上调
ApoE（载脂蛋白E）是簇5脊髓小胶质细胞中最丰富的转录物。SNI第3天，雄性和雌性的Apoe在mRNA水平表达上没有变化，但在第14天和第5个月时显著上调。为了研究小胶质细胞中ApoE转录物的上调是否会导致ApoE蛋白水平的变化，作者对雄性和雌性小鼠SNI后脊髓小胶质细胞中的ApoE进行量化。在SNI后第3天，Iba1标记的小胶质细胞中的ApoE水平较低，但在第14天和第5个月时显著升高。这些发现表明，ApoE在周围神经损伤后的小胶质细胞中持续上调，并提示ApoE可能在小胶质细胞对周围神经损伤的慢性反应中发挥作用。
图6 在神经病理性疼痛的慢性期，小胶质细胞中ApoE上调
6. 人类ApoE基因多态性与慢性疼痛相关
ApoE主要有三种基于单倍型的等位基因变体：ε2、ε3和ε4。作者发现ApoE多态性与不同的慢性疼痛报告相关。ApoE-ε4的男性携带者患慢性背痛和头痛的风险降低。但男性的ApoE-ε2会增加患慢性背痛、髋部疼痛、膝关节疼痛和胃痛的风险，并略微降低患慢性面部疼痛的风险。在女性中，ApoE多态性与疼痛之间的关联较弱，仅发现ApoE-ε4携带者患慢性背痛和头痛的风险降低。总之，与AD（阿尔茨海默病）直接相反，ApoE-ε4的携带者患慢性疼痛的风险降低，而ApoE-ε2的携带者患慢性疼痛的风险增加。
图7 人类载脂蛋白E基因多态性与慢性疼痛相关
7. 人类脊髓小胶质细胞在单细胞水平上的特征
作者从3823个细胞（从两女一男的人类脊髓样本中提取的）中获得高质量的转录图谱。无监督聚类分析确定了八个不同的小胶质细胞簇，均表达典型的小胶质细胞标记TREM2和C1QA。簇1对CSF1R、BHBLE41、FCGR1A、CTSS和GPR34基因高表达。簇2中的细胞获得了由早期基因主导的转录组特征，可能是由细胞分离过程诱导的。簇3中的小胶质细胞的特征是趋化因子CCL3和CCL4的表达，簇4小胶质细胞对LPL、SPP1、APOE、CD63和CTSB基因高表达。簇6中的细胞在积极生成新的蛋白质。簇7小胶质细胞显示出参与帕金森病发病机制的基因及TSPO的高表达，簇8小胶质细胞主要进行细胞分裂。
图8-1 人体脊髓细胞信息
图8-2 人脊髓小胶质细胞的scRNA序列分析
8. 簇特异性小胶质细胞转录组与人类疼痛基因的关联
作者将每个簇中的高表达基因映射到GWAS UK Biobank关于几种人类疼痛状态的结果。在小鼠中，发现小胶质细胞簇4和簇9与急性背痛相关的基因表现出强烈的相关性，而簇2小胶质细胞的转录组与慢性胃痛/腹痛相关的基因相关，簇2中最重要的个体基因是参与调节TNF和NF-κB信号的TANK和调节肌动蛋白动力学的TPM3。簇2、簇6和簇7中的人类小胶质细胞分别与急性面部疼痛、头痛和腹痛相关的基因相关，最高贡献基因是SRC。这些发现揭示了不同的小胶质细胞簇和疼痛状态之间的关联，支持这些亚群在调节人类疼痛中的潜在作用。
图9 小胶质细胞类型特异性转录组对人类疼痛遗传学的贡献
结论
1.通过单细胞RNA测序，我们发现周围神经损伤诱导雄性特异性炎性小胶质细胞亚型的产生，并证明与雌性小鼠相比，雄性小鼠的小胶质细胞增殖增加。
2.显示了周围神经损伤后不同小胶质细胞亚群的时间和性别特异性转录变化。簇9小胶质细胞增生程度相同，但在SNI后第3天，与雄性相比，雌性小胶质细胞增殖较少。但雄性和雌性小鼠之间的小胶质细胞总数未发生变化，有几种可能的机制需要在未来的研究中进行评估。这些机制包括：（a）雄性和雌性小胶质细胞增殖的不同时间动力学；（b）SNI后第3天雄性小胶质细胞凋亡增加（受此时雄性小胶质细胞凋亡相关基因表达改变的支持）；（c）增强雌性脊髓其他区域小胶质细胞的募集。
3.ApoE是小鼠周围神经损伤后慢性时间点脊髓小胶质细胞中最高上调的基因。且人类ApoE基因多态性与慢性疼痛有关。
4.确定了APOE与人类慢性疼痛之间的联系。簇2、簇6和簇7中的人类小胶质细胞分别与急性面部疼痛、头痛和腹痛相关的基因相关。
参考文献
Shannon Tansley. Single-cell RNA sequencing reveals time- and sex-specific responses of mouse spinal cord microglia to peripheral nerve injury and links ApoE to chronic pain[J].Nature Communications,13,843 (2022).
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