活化的T细胞亚群的单细胞eQTL分析揭示了疾病风险变异的激活和细胞类型依赖性效应

Single-cell eQTL analysis of activated T cell subsets reveals activation and cell type–dependent effects of disease-risk variants

期刊：SCIENCE IMMUNOLOGY

影响因子：26

发表单位：La Jolla Institute for Immunology, La Jolla, CA, USA.

研究背景

环境依赖的基因调控对于各种器官系统的最佳功能非常重要，特别是免疫系统，它需要对环境扰动做出快速反应。因此，免疫细胞的激活增加了对介导其效应功能很重要的基因的转录。当免疫细胞受到病原体或病原体相关分子等外部因素的挑战时，这种转录反应导致其功能特性的增强。要了解常见的基因变异在感染过程中如何影响免疫细胞的功能，就需要进行数量性状位点表达（expression quantitative trait loci, eQTL）研究，在模拟感染挑战的环境中检测基因表达。此外，当探索特定细胞类型中这种环境依赖效应时，评估同质细胞群的效应是很重要的。因此，使用受刺激免疫细胞的整体基因表达数据的eQTL研究可能同时评估遗传变异的细胞类型特异性和激活依赖效应。

方法流程

研究者激活了来自89个健康供体的CD4+T细胞，并对超100万个细胞进行了单细胞RNA测序实验，以检测遗传变异的细胞类型特异性和激活依赖效应。对19个不同的CD4+T细胞亚群的单细胞表达数量性状位点(sc-eQTL)进行分析，发现超过4000个基因的表达与常见的遗传多态性显著相关，这些基因大多数在特定的细胞类型中表现出最显著的影响。研究者从全基因组关联研究（GWAS）中发现疾病风险变异的基因之间的关联，并强调了其影响最显著的细胞类型。研究者还发现，生物学性别对CD4+T细胞亚群中激活依赖的基因表达有重要影响。

研究结果

1）活化的CD4+T细胞亚群的单细胞转录组

研究者使用T细胞受体(TCR)和共刺激分子CD28刺激CD4+T细胞，然后从每个供体(n=89)中分选出相同数量的8个已知的CD4+T细胞亚群。研究者为超100万个激活的CD4+T细胞生成了单细胞转录组，共刺激TCR显著增加了8个已知的CD4+T细胞亚群的超2500个转录本的表达，约500个转录本的表达模式也显示出了细胞类型特异性的差异。为了定义CD4+T细胞在激活后显示不同的转录谱，研究者对所有激活的细胞进行了无偏聚类分析。UMAP分析显示了19个不同的活化CD4+T细胞簇，大多数来自已知的CD4+T细胞亚群的细胞，这些簇为：Naive T_reg cells(cluster1)、T_H1 cells(cluster2)、T_H17 cells(cluster3)、T_FH cells(cluster4)、T_H2 cells(cluster5)、Naive CD4+T cells(cluster6)和Memory T_reg cells(cluster7)。研究者发现了几个小簇，如Follicular regulatory T cells(T_FR cells，cluster13)，Cytotoxic CD4+T cells(CD4-CTLs，cluster15)，最近描述的Interferon-response signature cells(T_HIFNR cells，cluster17)以及其他尚未详细描述的细胞簇。总之，对活化的CD4+T细胞进行的单细胞转录组分析显示了显著的细胞类型特异性和激活依赖的基因表达模式。

活化的CD4+T细胞亚群的单细胞转录组结果

2）活化CD4+T细胞亚群的sc-eQTL分析

为了识别具有基因型依赖性变化的基因(eGenes)，研究者使用了来自DICE供体(n=89)的基因型信息，并对19个不同的CD4+T细胞簇进行了独立的sc-eQTLs分析。在所有激活的CD4+T细胞簇中发现了4308个基因，这些基因中有14.8%与从GWAS中确定的疾病风险或性状相关变异有关。与之前报道的静息CD4+T细胞亚群中的eGenes相比，超1900个eGenes在激活条件下表现出更显著的基因型依赖性。此外，数百个eGenes的表达在激活条件下显示出与基因型更强的关联P值和效应值。以干扰素调节转录因子（IRF7）为例，研究者发现与系统性红斑狼疮(SLE)风险相关的基因变异(peak SLE-eqtlrs1061502^T/T)与activated CD4+T cells中IRF7基因的表达增加相关，为了确定IRF7在人T细胞中的功能，研究者敲低memory CD4+T cells中的IRF7的表达，并检测了全基因组对激活诱导的基因表达谱的影响。JAK-STAT信号通路（ (如IL2RA、IL2RB、JAK1、STAT5A、STAT5B)）和T细胞激活通路（如TNFRSF9 (4-1BB)、TNFRSF4 (OX-40)、TNFRSF18 (GITR)）中的几个基因表达增加，表明IRF7可能是T细胞激活的负调控因子。由于强连锁不平衡，超过300个cis-eQTLs与IRF7的表达相关。在IRF7启动子区域发现的eQTLs可能具有重要的功能；H3K27ac ChIP-seq和HiChIP的结果表明远端eQTLs也可能调控IRF7的表达。总之，研究者对活化的CD4+T细胞进行的sc-eQTLs分析强调了遗传变异对激活依赖性基因表达的影响的规模和程度。

活化的CD4+T细胞亚群的sc-eQTLs分析结果

3）基因变异的激活依赖效应在特定的细胞类型中最为显著

研究者发现大多数eGenes仅在特定的CD4+T细胞亚群中与遗传变异有显著的关联。与特定细胞类型的强关联并不总是与细胞特异性基因表达模式有关，因为eGenes在多个细胞亚群（未受影响/弱相关）中的表达，也观察到显著的细胞类型限制性关联。研究者观察到一些编码重要的T细胞效应分子的激活诱导的基因在特定的细胞类型中有很强的影响，例如eGenes CCL4和CCL20在T_H1和T_H17亚群中分别表现出最显著的eQTLs，CCL4编码趋化因子(C-Cmotif)配体4(CCL4)，也被称为巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1β)，它主要招募表达CCR5的免疫细胞。这种T_H1细胞驱动的CCL4-CCR5趋化轴已被证明在感染期间对CD8+T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和髓系细胞招募到淋巴结和组织中具有重要作用。CCL20通过招募表达CCR6的T细胞亚群（如T_H17、T_H1/17和T_reg细胞）到感染部位，在免疫应答中发挥重要作用。

遗传变异的激活依赖效应受到细胞类型的限制

4）与激活诱导的基因相关的疾病风险变异

通过将研究中发现的sc-eQTLs与已发表的GWAS变异重叠，发现超过600个基因与GWAS变异显著相关。通过全转录组关联研究（TWAS）发现几个激活依赖性的eGenes（TSLP, CAMK4, PHF5A）与过敏性疾病（花粉热、变应性鼻炎、湿疹和哮喘）相关。TSLP编码胸腺间质淋巴生成素(TSLP)，该蛋白已被证明可促进T_H2细胞反应，并在过敏性疾病中发挥作用。TWAS分析表明，T_FH细胞中TSLP的表达增加会导致过敏性疾病的风险，TWAS研究还表明，在T_H17细胞、T_H2细胞和T_FR细胞中，过敏和哮喘的风险与CAMK4的表达增加有关，该基因编码一种多功能的钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV(CaMK4）。PHF5A与过敏性疾病的关联是一个新发现。为了进一步探索该eGenes在CD4+T细胞功能中的作用，研究者敲低memory CD4+T cells中PHF5A的表达，并通过分析其单细胞转录组来检测其全基因组对激活诱导的基因表达模式的影响。敲低研究导致T细胞激活marker[TNFRSF9(4-1BB)和TNFRSF18(GITR)]和细胞因子/趋化因子(IL23A、CCL5、CCL20)的基因表达增加，这些marker与哮喘和过敏性炎症有关。这些在人CD4+T细胞中的功能研究表明，PHF5A可能在T细胞分化和效应功能中发挥重要作用；因此，调节其表达水平的遗传变异可能在过敏性疾病中具有重要的功能后果。然而，还需要对模式生物进行进一步的研究来确定这些基因在疾病发病机制中的作用。

与激活诱导的eGenes相关的疾病风险

5）性别对激活诱导的基因表达模式有重要影响

生物性别会影响自身免疫性疾病的风险以及接种疫苗和感染的结果。比如，男性在患SARS-CoV-2疾病之后患严重疾病的风险更高，而女性患多种自身免疫性疾病（如SLE）的风险更高。个体的生物学性别影响免疫反应的机制尚未被充分探讨。为了确定性别如何影响激活的CD4+T细胞的功能特性，研究者检测了每个CD4+T细胞亚群中男性和女性之间差异表达的转录本（性别偏倚的转录本）。发现有960个转录本表现出性别偏倚的表达，大多数转录本以高度细胞类型特异性的方式表现出性别偏倚的表达。最重要的是，>90%的性别偏倚转录本仅在激活的CD4+T细胞亚群中观察到。这些发现表明，性别对CD4+T细胞亚群的激活依赖性的基因表达有重要影响。接下来，研究者进行了基因注释富集分析，以探索性别偏倚的基因表达模式对活化的CD4+T细胞功能的生物学效应。性别偏倚转录本明显在几个CD4+T细胞的启动和执行效应功能所必需的通路上富集，如TCR信号、细胞因子、细胞因子受体、共刺激、凋亡和细胞粘附途径。其他显著富集的通路与在驱动CD4+T细胞的效应功能中发挥关键作用的转录因子有关。总之，与CD4+T细胞效应功能相关的关键分子表达的重要变化可能解释了在感染和自身免疫性疾病中性别对免疫反应的巨大影响。

性别对激活诱导的基因表达模式有着重要影响

讨论

T细胞是淋巴细胞的主要组分，具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，是身体中为抵御疾病感染、肿瘤而形成的英勇斗士。其中的CD4+T细胞，是适应性免疫反应的关键协调者。鉴于这些辅助T细胞在活化后执行的重要功能，它们表达的基因与很多人类疾病的风险可能有着密切关系。为此，针对CD4+T细胞活化后的基因表达差异，美国拉霍亚免疫研究所的研究团队展开了一项详细的分析。

研究者对超100万个细胞进行单细胞测序，根据激活后基因表达模式的差异，分析结果显示了19组CD4+T细胞的特征，不仅包括了过去已知的几大亚群，还揭示了鲜少有研究的一些新的小亚群。还通过eQTLs分析了这些T细胞的基因表达信息，发现许多常见遗传变异对基因表达的影响仅在细胞被激活后的特定细胞中强烈表现。研究结果还发现，CD4+T细胞的工作方式受到生物学性别的重大影响。来自男性和女性志愿者的活化的CD4+T细胞，在多个方面显示出了“男女有别”，包括不同亚群与其他免疫细胞的交流方式，对抗感染时产生细胞因子的方式等等。

本研究对CD4+T细胞亚群之间的基因表达差异提供了迄今为止最深入和全面的信息。

参考文献

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[2]V. Chandra, S. Bhattacharyya, B. J. Schmiedel, A. Madrigal, C. Gonzalez-Colin, S. Fotsing, A. Crinklaw, G. Seumois, P. Mohammadi, M. Kronenberg, B. Peters, F. Ay, P. Vijayanand,Promoter-interacting expression quantitative trait loci are enriched for functional genetic variants. Nat. Genet. 53, 110–119 (2021).

[3] B. J. Schmiedel, D. Singh, A. Madrigal, A. G. Valdovino-Gonzalez, B. M. White,J. Zapardiel-Gonzalo, B. Ha, G. Altay, J. A. Greenbaum, G. M. Vicker, G. Seumois, A. Rao,M. Kronenberg, B. Peters, P. Vijayanand, Impact of genetic polymorphisms on human immune cell gene expression. Cell 175, 1701–1715.e16 (2018).

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