肠道微生态中隐藏的调控者---宏病毒组
说起肠道微生物，你首先想到的是什么呢？ Bacteria ?Fungi ?但是很少有人会注意到另一种更微小的生物体--病毒（Viruses），科学家们将这个天然存在于肠道的组织称为“病毒组”-Virome，它与肠道中的其他菌群一起构成了“肠道微生态”—Microbiome。有研究表明，虽然“病毒组”的成员们“个头儿“极小，但它们却时刻准备着用自己微小且灵活的身躯对抗外界感染，为捍卫肠道的稳定使出自己的“洪荒之力”。
人肠道微生物组成概览（Lagieret al，2012）
并非所有的病毒都是有害的！在人体肠道病毒组中，温和噬菌体(temperatephage)占绝大多数。温和噬菌体（Temperatephage）亦称溶原性噬菌体(lysogenic phage)，其感染宿主细菌后不会立即引起细菌的裂解，而是与宿主建立一种互利共生的关系。温和噬菌体在感染宿主时，会根据周围的环境来决定是裂解还是溶原状态。例如，芽孢杆菌(Bacillus)噬菌体就能够产生一种多肽分子并释放到周围环境中作为彼此之间交流的信号，子代噬菌体通过感知多肽分子的浓度来决定是否进入溶原状态，如当多肽分子浓度较高时则进入溶原状态。
另外，早期研究显示，噬菌体含有对宿主细菌有利的基因，比如毒力因子相关基因，同时，噬菌体可以通过基因的水平转移使细菌快速产生对药物的抗性，并对人体健康造成一定程度的影响。
病毒宏基因组学（Viral Metagenomics）是在宏基因组学理论的基础上，结合现有的病毒分子生物学检测技术而兴起的一个新的学科分支，是某类样本中所有病毒(virus)或病毒类似物(virus-like-particle)及其所携带遗传信息的总称。病毒可以说是地球上最大的生物实体之一，但是由于他们形态极小，遗传物质进化快的特点，不能像细菌、古菌等微生物一样有系统的发育标记，使得对其鉴别有一定难度。另外，关于病毒和宿主相互关系的研究，也是被限制在了可培养的病毒-宿主系统中，使得对其研究起来十分困难。
面对这些困难，科学家们另辟蹊径，换一种角度去打量病毒，发现病毒其实是很适合用高通量测序的手段来研究的，比如大部分病毒有着坚固的衣壳，这样就可以使用一些物理或化学的手段将其进行富集、分离。另外，相比于其他生物的遗传信息病毒基因组较小，就更有利于使用生物信息技术进行全基因组组装。
在肠道微生物组的宏基因组测序中，来自病毒基因组的DNA在微生物群落的总 DNA 中所占比例非常小，这是因为大多数病毒的基因组太小，尤其是其在低水平存在的情况下很难获得。所以在宏病毒的研究中，病毒颗粒物（VLPs）生物富集和纯化是至关重要的。肠道内容物中病毒颗粒物的纯化方法大致为：先用缓冲液悬浮粪便样本，然后根据不同微生物个体大小或密度重量不同，用滤膜过滤或CSCl梯度密度离心的方式去除宿主细胞和细菌等污染，以达到富集病毒颗粒的目的。下面通过一篇文献综述，向大家介绍几种不同的富集方法。
论文标题：Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes
刊登日期：2015年1月22日
发表杂志：BMC Genomics
测序模式：Illumina HiSeq 2500
实验材料：人工肠道微生物群体样本，样本组成如下：
（1）无菌小鼠粪便
（2）六种病毒噬菌体： P22、T3、T7、ɸVPE25、ɸ6和M13，其中P22、T3、T7、 ɸVPE25代表四种dsDNA病毒， M13代表ssDNA病毒，ɸ6代表ssRNA病毒 ；
（3）两种细菌：革兰氏阳性菌 Listeria monocytogenes EGD-e和革兰氏阴性菌Bacteroides thetaiotaomicron VPI5482
其中六种噬病毒菌体为等数量加入，两种细菌为等数量加入；最后总噬菌体数量和总细菌数量相等
用于比较这5种富集方法的样本前处理方式保持一致，即各取270mg人工肠道微生物样本，用SM buffer悬浮进行低速离心处理，离心后保留上清液体，其中每种富集方法各设两个平行实验，进行以下五种富集处理：
（1）FD：滤膜过滤+Dnase消化 ；
（2）DTT： DTT+滤膜过滤+ Dnase消化 ；
（3）CsCl： 滤膜过滤+ Dnase消化+CsCl密度梯度离心 ；
（4）PEG： 滤膜过滤+ Dnase消化+PEG8000沉淀浓缩 ；
（5）MG：the Total Metagenome提取。
这里需要说明的是，作者在进行PEG：滤膜过滤+ Dnase消化+PEG8000沉淀浓缩方法时，由于PEG加入滤液时形成了粘稠的高分子化合物，而这种化合物在后续操作中无法去除而导致实验失败。所以后续操作只展示其他四种富集方法的实验比对结果。
Figure 1 Schematic diagram of VLP purification methods
测序模式：Illumina HiSeq 2500
1. Purification efficiency—方法间纯化效率的比较
Figure 2 Read abundances from artificial intestinal microbiota samples following VLP purification or whole . genome sizes.(A) Relative read abundancesmetagenome processing. (B) Relative read abundances after normalization to
从Figure 2A可以看出，对于病毒类似物（VLPs）未经富集的样本得到的测序数据中，比对到噬菌体病毒的reads只占不到5%，而VLPs经三种富集方式（FD，DTT 和CsCl）处理的样本得到的数据中比对到噬菌体的reads均大于80%，并且用CsCl方法富集的样本宿主去除率最高，其次是DTT富集方法，最后是FD方法。
将测序数据中比对到小鼠宿主的数据滤掉之后重新计算各自的数据占比，如图Figure2 B所示，用CsCl方法富集的样本数据中比对到噬菌体P22的reads数明显偏高，比对到ɸVPE25的reads则偏少，说明通过CsCl梯度离心方式富集粪便样本时，对不同密度的噬菌体有较为明显的偏好性。
2. Removal of bacterial and host DNA ---细菌和宿主DNA去除效率的比较
Table1 Removal efficiency of mouse and bacterial DNA by different purification methods
从Figure 2和Table1可以看出，与未经病毒类似物富集的实验方法比，三种纯化方式在去除宿主DNA和细菌DNA均是非常成功的，富集倍数均可达到40000倍以上。其中CsCl方法的富集效果最佳，达到49077倍，FD富集效果最弱，但也有41517倍。这些变化的富集倍数均可表明，在去除细菌DNA时，这三种纯化方式的去除率均可达到99.99%以上。
在粪便组织样本的研究中，宿主DNA的污染对VLPs研究的干扰也不容忽视，所以在选择纯化方式时，应将宿主DNA的去除效率也考虑进去。文章中采用的三种纯化方式，在宿主DNA的去除中差异较为明显。用比对到噬菌体的reads数与比对到小鼠的reads相比，FD只有55倍的变化，意味着该方法对宿主DNA的去除率为98.1%，而CsCl有768的富集倍数，表示去除率为99.87%。
3．Effects of nucleic acid composition of phage genomes--噬菌体基因组组成对的实验结果的影响
Table 2 Assembly statistics
如Table 2所示，将所得测序数据进行de novo拼接组装，获得了P22、ɸVPE25、T3和T7四种dsDNA病毒基因组的全长序列，以及ssDNA 病毒M13的部分序列。
文章中，作者主要关注的是dsDNA噬菌体基因组的测序结果，然而在这个人工模拟肠道微生物群体中，作者也加入了两种非双链DNA病毒 ɸ6和M13用来验证dsRNA病毒和ssDNA病毒的基因组是否可以用以上测试方法获得。为了确定测序结果中ɸ6噬菌体序列的测序情况，作者把FD和MG方法获取的样本分别进行了cDNA的合成，但是由于样本中ɸ6噬菌体的RNA含量过低而导致建库失败，所以在包含MG方法在内的所有纯化方式获得测序结果中，均没有测到属于ɸ6噬菌体的reads。然而令人惊奇的是，在所有的测试样本中均测到了一小部分ssDNA病毒M13的序列。理论上，按照Illumina文库制备过程，只有双链DNA才可以进入建库流程，而单链DNA由于不能连上测序接头，而不能进入测序阶段的。因为通常来讲，建库时用于连接Illumina测序接头的T4 DNA连接酶只对dsDNA起作用。然而，从测序比对结果可以看出，T4 DNA ligase也可以作用于ssDNA，尽管此时的连接效率非常低（Kuhn and Kamenetskii，2005）。这个可能可以用来解释为什么测到了部分ssDNA病毒的序列。同时这些结果也表明，如果有足够多的reads产生，上述几种纯化方式都可以用于定性的评估ssDNA病毒的存在情况，但是若要更加清晰的了解ssDNA和RNA病毒的存在状态，还需要采取其他研究手段。
结论文章中，作者利用已知细菌和病毒组成的人工肠道微生物样本，对病毒类似物(virus-like-particle)的四种纯化方式进行了评估。除了PEG法在纯化过程中失败了，其他三种方法在不同方面各有优势。与FD和DTT法相比，CsCl纯化方式在去除宿主DNA时有明显的优势，但该方法对特殊噬菌体的选择偏好性较为明显，而FD和DTT在纯化时表现出了更好的均一性，并且DNA得率也更高。FD和DTT两种方法获得结果差异较小，并且当粪便样本滤液较为粘稠时可采取DTT纯化方法，以降低滤液粘稠度，减少滤膜阻塞。另外在设计病毒宏基因组的研究实验时，另一个至关重要的因素需要考虑，就是在实验时需要加入阴性对照以去除纯化、建库和测序时引入的污染干扰。
1 Norman J M, Handley S A, Baldridge M T, et al. Disease-specific alterations in the enteric virome in inflammatory bowel disease[J]. Cell, 2015, 160(3):447-460.
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4 Lagier J C, Million M, Hugon P, et al. Human gut microbiota: repertoire and variations.[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2012, 2(11):136.
5 Qi Y, Fan J, Ma Y. Research progresses in human gut virome[J]. ActaMicrobiologicaSinica, 2017.