m6A脱甲基酶ALKBH5维持致瘤性 | m6A专题
标题：m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stemlike Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program
（m6A去甲基化酶ALKBH5通过维持FOXM1的表达调控胶质瘤干细胞的增殖）
刊登日期：2017年04月
发表杂志：Cancer Cell
N6-甲基腺苷（m6A）是mRNA中最普遍的内部修饰，近几年关于m6A机制的论文较多，但其在人类癌症中的功能尚不清楚。本文作者研究发现，m6A去甲基化酶ALKBH5的过表达是胶质瘤干细胞增殖和肿瘤发生所必需的，并且FOXM1是介导ALKBH5在胶质瘤干细胞中的关键靶标。另外还发现了一个lncRNA能促进ALKBH5对FOXM1新生转录物的去甲基化。
作者查询了TCGA，R2，Freije，Phillips和REMBRANDT肿瘤相关的数据库，在所有数据集中，ALKBH5表达升高预示GBM患者预后较差。然后，作者检测了不同阶段恶性肿瘤的原发胶质瘤细胞系中ALKBH5的表达，发现在胶质瘤干细胞（GSC）中ALKBH5表达显著增加。为了确定ALKBH5是否对GSC自我更新很重要，作者使用了两种不同的短发夹RNA（统称为shALKBH5）来干扰ALKBH5的表达。发现shALKBH5能显著降低GSC11，GSC17和GSC23的肿瘤形成率，并且能降低Nestin以及SOX2，Nanog和Oct4（肿瘤细胞自我更新的转录因子）的表达，从而证实了ALKBH5对GSC自我更新的影响。
接着，作者在GSC11，GSC17和GSC23胶质瘤细胞中，验证了ALKBH5的敲低能够抑制细胞生长和增殖（图2A）。并且作者还将shCtrl或shALKBH5转染的GSC11或GSC17细胞通过颅内注射小鼠，来研究ALKBH5敲减对GSC致瘤性的影响。结果显示，那些注射shALKBH5-GSC细胞的小鼠表现出更长时间的存活率，且具有较低的肿瘤形成率（图2D）。 此外，通过过表达野生型ALKBH5（图2E），可有效补救shALKBH5对脑肿瘤形成的抑制。上述结果都表明，ALKBH5的去甲基化活性对于GSC致瘤性是关键的。
接下来，作者采用基因表达谱芯片分析在GSC11和GSC17细胞中不同shRNA对ALKBH5敲低后的基因表达差异情况。筛选在两种细胞系中差异表达至少2倍的206个基因用于Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析。结果发现大部分的基因主要涉及”Cell Cycle（细胞周期）”，其次是”Cellular Assembly and Organization（细胞组装和组织）”和”DNA Replication,Recombination, and Repair（DNA复制，重组和修复）”（图3A）。
芯片鉴定的206个差异基因中，在RNA-seq数据集（Input）中发现了148个基因，其中具有差异表达至少2倍的85个基因含有5053个独特的m6A峰，鉴定了包括 ABHD4, ANP32E, CENPF,FANCI, FOXM1, MKI67, BCL2, UBE2C, NT5E, IGFBP5, TSPYL2和CDCA2在内的12个基因的13个峰。在这些基因中，FOXM1是已有研究报道的细胞周期调控中的关键转录因子，在GSC的自我更新和肿瘤发生过程中有重要作用。（图3F）
为了研究FOXM1是ALKBH5的直接底物，作者先检测了ALKBH5敲低后总mRNA表达和FOXM1不同亚型水平的变化（图4A）。与m6A_seq数据一致，在ALKBH5敲低的GSC11和GSC17细胞中FOXM1下调约70％-80％。并且瞬时转染处理（siRNA）和shRNA慢病毒稳定转染的敲低处理都使FOXM1蛋白的表达丰度下降（图4B,C）。为了确定FOXM1新生转录物(pre_mRNA)是否是ALKBH5的作用底物，作者使用MeRIP与qPCR结合来确定ALKBH5敲低后FOXM1的m6A甲基化水平。结果证明了m6A甲基化大部分在FOXM1的pre_mRNA上检测到。 而野生型ALKBH5的过表达能够恢复FOXM1的表达水平，表明ALKBH5主要通过其去甲基化活性影响FOXM1的表达变化。
前面m6A_seq的结果表明FOXM1中的m6A峰在终止密码子附近有一个峰和在3'UTR有一个独特的峰（unique peak）。所以作者进一步研究了FOXM1 3'UTR区域的重要性，用FOXM1CDS-3'UTR构建体转染的GSC中FLAG-FOXM1表达显着降低，表明了3'UTR参与ALKBH5 -FOXM1的调控过程。随后作者发现12号染色体（chr12：2945982-2968961，GRCh37/hg19）的长非编码RNA LOC100507424（简称为FOXM1-AS）的转录方向与FOXM1相反，并且与FOXM1 mRNA的最后一个外显子有457个核苷酸互补（图6A）。
接下来，作者进一步研究发现，FOXM1-AS与FOXM1新生转录物和ALKBH5蛋白相互作用，而且敲低FOXM1-AS能导致ALKBH5相关的FOXM1新生转录物和蛋白质的表达显着降低，此外，shFOXM1-AS显着降低GSC生长和抑制肿瘤球的形成。表明FOXM1-AS在参与ALKBH5和FOXM1的过程中起到正调控作用。
作者研究发现m6A去甲基化酶ALKBH5在胶质瘤干细胞 (GSCs)中显著表达，当沉默ALKBH后会抑制GSCs的自我更新和增殖。结合基因表达谱芯片和m6A-seq分析发现，细胞周期调控中的关键转录因子FOXM1是ALKBH5靶基因。同时，lncRNA FOXM1-AS 促进了 ALKBH5和FOXM1 初级转录本的相互作用，揭示了m6A去甲基化酶ALKBH5在胶质瘤中发挥重要作用。
原文：Zhang S, et al. m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program. Cancer Cell, 2017, 31(4):591.