Plant Physiology | 植物中miRNA和siRNA功能分析的病毒卫星DNA载体

用于植物中miRNA和siRNA功能分析的病毒卫星DNA载体（TYLCCNV）

A Viral Satellite DNA Vector (TYLCCNV) for Functional Analysis of miRNAs and siRNAs in Plants

发表单位：中国农业大学

发表期刊：Plant Physiology

影响因子：5.949

技术手段：miRNA测序，降解组测序（联川生物提供）

研究背景

利用实验和生物信息学方法，在植物中发现了许多小RNA，包括miRNA和小干扰RNA（siRNA），它们在各种生物调节过程中发挥着重要作用，包括叶片发育、非生物和生物胁迫等。作为植物生理学领域的热点，迄今为止仅开发了几种病毒载体来过表达miRNA，这一方法在植物中的应用有限。

中国番茄黄化曲叶病毒（TYLCCNV）与甘蓝卷叶病毒（CaLCuV）和棉花皱叶病毒（CLCrV）一样，属于菜豆金黄花叶病毒属，双生病毒科，并且在细胞核中复制，因此研究人员推断该病毒也可用作病毒启动子以驱动miRNA前体形成成熟miRNA。TYLCCNV由DNA-A和DNA-β组成。DNA-A作为辅助病毒，是一种约2.7Kbp的环状单链DNA（ssDNA），编码六种基因，包括AC1，AC2，AC3，AC4，AV1和AV2；DNA-β作为β卫星，是一种约1.3Kbp的ssDNA，编码一个βC1基因。TYLCCNV载体，作为病毒诱导的基因沉默（VIGS）和病毒诱导的基因转录沉默（VITGS）载体，已被用于诱导转录基因沉默或转录后基因沉默，而不会在植物中引起任何明显的病毒症状。

本研究报道了一种新的TYLCCNV载体，它可以有效地过表达amiRNAs（artificial miRNAs），也可以过表达内源性小RNA，以研究它们在本塞姆氏烟草中的生物学功能。

研究方法

将本塞姆氏烟草在22℃，16小时光照/ 8小时黑暗循环的生长室中培养。将所有病毒感染性克隆分别导入土壤农杆菌菌株GV3101中后利用农杆菌渗入法进行后续处理。收集植物组织，立即在液氮中冷冻，并储存在-80℃冰箱中备用。

研究结果

在这项研究中，研究人员通过中国番茄黄化曲叶病毒（TYLCCNV）载体相关的病毒卫星DNA报告了一种新的小RNA过表达系统，该载体不仅可以高度过表达人工和内源miRNA，而且可以在本塞姆氏烟草中高效过表达内源siRNA。

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01

为了优化过表达amiRNA系统，本研究采用不同的amiRNA骨架和构建amiRNA前体的策略来生成高丰度amiRPDS。通过转基因技术过表达miRNA的amiRNA骨架中，本研究选择了3种amiRNA，分别是AtMIR319a、SlMIR159以及AtMIR390a。AtMIR319a前体广泛应用于本塞姆氏烟草、拟南芥、番茄等植物中，通过转基因技术或病毒诱导CaLCuV和CLCrV过表达miRNA。SlMIR159前体在番茄中已被报道可诱导特异性amiRSlDCL3上调，使21-和22-nt sRNA水平显著升高，24-nt sRNA水平显著下调。对于AtMIR390a前体，在拟南芥中被发现，且比AtMIR319a前体产生更多的miRNA。

将这3种amiRPDS前体分别克隆到TYLCCNV中，形成TYLCCNV-amiRPDS(319)、TYLCCNV-amiRPDS(159)和TYLCCNV-amiRPDS(390)载体沉默PDS基因。TYLCCNV-amiRPDS(319)、TYLCCNV-amiRPDS(159)、TYLCCNV-amiRPDS(390)感染的本塞姆氏烟草均可在浸润后2 ~ 3周左右诱导叶片、茎、花组织的叶脉出现明显的植物光白表型。且TYLCCNV-amiRPDS(390)浸润的植株表现出比其他载体更为明显的表型。进一步RT-qPCR和northern-blot分析也显示，TYLCCNV-amiRPDS(390)比其他载体产生更多的amiRPDS。在所有被TYLCCNV-amiRPDS(319)、TYLCCNV-amiRPDS(159)和TYLCCNV-amiRPDS(390)感染的本塞姆氏烟草中均可检测到pri-amiRPDS，但在受TYLCCNV感染的对照植物中不能检测到。此外，与TYLCCNV感染对照植株相比，这3株TYLCCNV - amiRPDS植株PDS mRNA水平显著降低。这些结果表明，TYLCCNV载体可以过表达特异性amiRNA，有效诱导本塞姆氏烟草植物基因沉默，并选择AtMIR390a用于进一步研究。

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02

为了证实TYLCCNV载体产生的小RNA可以特异性过表达amiRPDS并切割浸润叶片中的靶向PDS转录物，研究人员分别进行了小RNA测序和降解组测序。研究结果表明，TYLCCNV-amiRPDS（390）特异性过表达amiRPDS且在植物中发挥其生物学作用，表明TYLCCNV-amiR（390）载体可用于进一步研究。

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03

为了评估基于TYLCCNV的miRNA过表达载体是否可以用来表征植物内源性miRNA的功能，构建了TYLCCNV-amiR156载体，在本塞姆氏烟草植物中过表达miR156b。研究结果表明，与TYLCCNV感染的对照植物相比，在TYLCCNV-amiR156浸润的植物中TC17947和TC24007的mRNA水平显著降低，说明该载体可用于有效研究植物内源miRNA的功能。

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04

为了确定基于TYLCCNV的小RNA过表达载体是否可用于研究植物内源siRNA的功能，将拟南芥TAS3a-59D8（+）tasiRNA序列构建到TYLCCNV-amiR（390）载体中以产生59D8（+）。在TYLCCNV-59D8（+）感染的植物中，ARF3和ARF4基因表达明显高于TYLCCNV感染的对照植物。结果表明，使用TYLCCNV-amiR（390）载体促进特异性内源性tasiRNA表达可有效诱导本塞姆氏烟草的预期分子和形态变化，表明TYLCCNV-amiR（390）载体可以前瞻性地应用于评价植物内源性tasiRNA的功能。

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05

为了进一步检测TYLCCNV载体是否是一种有用的人工工具，其21nt的短序列用于诱导植物中的功能基因沉默，选择Su和PCNA基因来设计和构建TYLCCNV-amiRSu和TYLCCNV-amiRPCNA载体。结果表明，在接种含有TYLCCNVamiRSu和TYLCCNV-amiRPCNA载体的土壤农杆菌后，人工amiRNA在本塞姆氏烟草植物中高度积累。此外，TYLCCNV-amiRSu和TYLCCNV-amiRPCNA渗入的叶组织中Su和PCNA的mRNA水平均显著低于TYLCCNV感染的对照植物。综上所述，基于TYLCCNV的amiRNA载体可用于过表达特定的21-nt amiRNA，以充分诱导本塞姆氏烟草植物中的靶基因沉默。

图  小RNA和降解组测序数据以表明TYLCCNV-amiRPDS（390）载体过表达特定小RNA并切割靶向PDS基因mRNA

研究讨论

TYLCCNV载体是作用于小RNA的一种通用且高效的载体。一般而言，有两种策略可过表达小RNA，用于人工调节植物中的小RNA。一种是amiRNA技术，另一种是合成的反式作用小干扰RNA（syn-tasiRNA）技术。

作为一种有效的特异性基因沉默技术，amiRNA已广泛应用于多种植物的功能基因组学，如拟南芥，水稻和番茄。该技术主要通过各种amiRNA骨架开发，如AtMIR319a，AtMIR390a和SlMIR159。另外，还有报道表明amiRNA技术通过水稻和拟南芥中的遗传转化过表达tasiRNA OstasiR2141。

syn-tasiRNAs技术可以通过用拟南芥中TAS3a的指定序列替换5'D7（+）和5'D8（+）或替代3'D3（+）和3'D4（+）来有效诱导基因沉默。拟南芥TAS1c syn-tasiRNA序列与miRNA序列相似，例如atasiRPDS，因此该技术也可以用miRNA序列取代syn-tasiRNA，但这会导致特定miRNA过表达。

目前，有两种miRNA加工机制，一种是base-to-loop，另一个是loop-to-base。在骨架设计和构建中都考虑了这两种miRNA加工机制，并采用简化amiRNA前体的构建并对miRNA积累保持完全可靠的效果。MiR390前体可作为amiRNA过表达的良好候选骨架。

参考文献

Ju, Z., Cao, D., Gao, C., Zuo, J., Zhai, B., Li, S., … Zhu, B. (2017). A Viral Satellite DNA Vector (TYLCCNV) for Functional Analysis of miRNAs and siRNAs in Plants. Plant Physiology, 173(4), 1940–1952. 

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