FFPE样本制备及分析——DNA样品质控&实用研究| 实验技术专题

DNA样品质控

尽管最佳的裂解和孵育条件可从FFPE样品中释放DNA，部分逆转甲醛修饰，但对于纯化后DNA的下游分析，仍有一些限制。首先，固定过程中的化学修饰可能引入不想要的序列变化，降低DNA稳定性和酶学分析的效率，让A260/A280的纯度分析变得困难。其次，由于FFPE样品中的DNA随时间而逐渐片段化，故只能分析短序列（例如在PCR应用中，应当设计产生短扩增子的引物）。此外，较短的DNA片段可能导致DNA产量的过高估计，因吸光值读数更高。所以对于FFPE样本需要进一步质控，才能进行后续实验及分析。

市面上有Swift 和KAPA公司使用不同长度的引物来扩增大量存在于人类基因组中的序列，根据qPCR产物比值来评估样本质量， Alu247/Alu115：Alu重复序列是哺乳动物基因组中SINE家族的一员，约有50万份拷贝。平均4～6 kb中就有一个Alu序列，是中度重复序列DNA。由于这种DNA序列中有限制性内切核酸酶AluⅠ的识别序列AGCT，所以称为Alu重复序列。通过长 (247 bp; Alu247) 、短(115 bp; Alu115) 扩增子比值可评估gDNA的完整度。

Q Score：即Quality Score，是指不同qPCR扩增产物浓度的比值。常用的Q129/Q41和Q305/Q41比值分别指129bp和41bp产物、305bp和41bp产物浓度比值。以及Agilent公司DIN：即 DNA Integrity Number，是指DNA经安捷伦生物分析系统 2100/4200 TapeStation分析并计算的出的数值，是对DNA完整性的评分（表1）

表1不同厂商DNA质控标准

使用了DIN值和Q129/Q41来对不同FFPE样本DNA进行质量检测，结果显示DIN值和Q129/Q41具有很好的相关性，均能很好的衡量DNA的质量。

图 不同质控参数对FFPE样本(Blocks 1–5)的DNA质量评估显示DIN值和Q129/Q41具有很好的相关性

实验结果表明Q score>0.4或者DIN>3.5时，样本DNA即可对目标区域进行更有效的覆盖，此时文库丰度较好，可获得可靠的测序数据。

图 最大平均测序深度与Q score和DIN值的关系

随着FFPE样本DNA的Q score值和DIN值提高，最大平均测序深度（Max mean coverage）也相应线性提高。

实用研究

1.FFPE样本的储存时间和其DNA质量、文库构建质量以及WES检测关系

Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue 

文中选用的是高度恶性的卵巢浆液性腺癌（high-grade serous ovarian adenocarcinomas）FFPE样本，对FFPE样本的储存时间和其DNA质量、文库构建质量以及WES检测结果进行评估。

首先从3个样本中各选取了20个FFPE样本（组织学、形态学符合要求，切片中50%以上为恶性肿瘤细胞，50%以下为坏死细胞），其中一个样本因存储时间不详去掉。这些样品按照存储时间分为3组（3-12年、13-22年、23-32年）。每张切片取不同位置的组织样品进行DNA提取，剩余的59个样本中有一个FFPE样本因提取出来的DNA含量极低而舍弃，最后共计对58个样品进行了外显子测序（WES），成功测序53个。

图 FFPE样本WES测序流程

检测文库制备前的DNA质量指标Q129/41比值，是FFPE样本中基因组DNA片段化的量度。DNA总量与DNA质量（Q129/41）与储存时间呈现显著相关，保存时间越久，质量越差。

图 DNA质量与切片储存时间

外显子文库大小与储存时间呈负相关，每多保存10年文库大小约减少9bp（图中圆点为外显子文库构建成功的FFPE样本，叉号为未成功的）。

图 文库大小与切片储存时间

其中有5例FFPE样本文库外显子测序产量很低或几乎没有产量，这些样本建库前的Q129/41低于0.03，说明建库前进行Q129/41检测是必要的。

图  FFPE样本储存时间和WES测序深度相关性分析

对测序数据进行分析可以看出储存时间显著影响目标区域覆盖度（>20X）、测序深度和文库冗余度（Duplication），储存时间越久，数据越差。碱基转换/颠换（Ti/Tv）比例则随着储存时间的延长而升高，可能是由于FFPE样本中DNA的化学修饰比较多，比如脱氨基。

表2标本保存时间的全外显子数据比较

2.FFPE样本与新鲜样本之间捕获测序效果的比较

Target enrichment protocol for preparing formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples for next-generation sequencing

样品：新鲜冻存和FFPE保存的正常结肠组织分别提取DNA

捕获平台：NimbleGen’s Comprehensive Cancer Panel Design

样品起始量：500ng、250ng、100ng，实验进行一次重复

测序：Hiseq 2000, 2 lane

结果：使用FFPE样本除了duplication率明显高于新鲜冻存的组织样品外，其他数据与Fresh Frozen差别不大。在使用100ng起始量时，mean coverage和median coverage都低于新鲜冻存样本。

表3新鲜冷冻和FFPE样品性能指标的比较

在1X、20X、40X深度以上的目标区域覆盖度在两种样本中基本没有差别；80X、100X深度以上的目标区域覆盖度仅100ng FFPE样本偏低，500ng和250ng基本无差别。

图 覆盖度大于或等于1倍、20倍、40倍、80倍和100倍的Bases百分比

250ng和500ng起始量两种类型的样本间相同的SNP数量较多，但是随着覆盖度筛选深度增加，新鲜冻存样本得到的SNP数量也会有所增加。100ng起始量两种类型的样本间相同的SNP数量明显减少。

图 新鲜冻存和FFPE样本在不同起始量gDNA input下20X和40X Venn图比较

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